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I vettori genici per il trattamento della fibrosi cistica polmonare devono essere mirati alle vie aeree conduttrici, poiché la trasduzione polmonare periferica non ha alcun effetto terapeutico.L'efficienza della trasduzione virale è direttamente correlata al tempo di residenza del portatore.Tuttavia, i fluidi di rilascio, come i portatori di geni, si diffondono naturalmente negli alveoli durante l'inalazione e le particelle terapeutiche di qualsiasi forma vengono rapidamente rimosse dal trasporto mucociliare.Estendere il tempo di permanenza dei portatori del gene nel tratto respiratorio è importante ma difficile da ottenere.Le particelle magnetiche coniugate con il trasportatore che possono essere dirette verso la superficie del tratto respiratorio possono migliorare il targeting regionale.A causa di problemi con l’imaging in vivo, il comportamento di tali piccole particelle magnetiche sulla superficie delle vie aeree in presenza di un campo magnetico applicato è poco compreso.Lo scopo di questo studio era di utilizzare l'imaging al sincrotrone per visualizzare in vivo il movimento di una serie di particelle magnetiche nella trachea di ratti anestetizzati al fine di studiare le dinamiche e i modelli di comportamento delle particelle singole e sfuse in vivo.Abbiamo poi valutato anche se il rilascio di particelle magnetiche lentivirali in presenza di un campo magnetico aumenterebbe l'efficienza della trasduzione nella trachea del ratto.L'imaging a raggi X al sincrotrone mostra il comportamento delle particelle magnetiche nei campi magnetici stazionari e in movimento in vitro e in vivo.Le particelle non possono essere facilmente trascinate attraverso la superficie delle vie aeree viventi utilizzando i magneti, ma durante il trasporto i depositi si concentrano nel campo visivo, dove il campo magnetico è più forte.Anche l’efficienza di trasduzione è aumentata di sei volte quando le particelle magnetiche lentivirali sono state erogate in presenza di un campo magnetico.Presi insieme, questi risultati suggeriscono che le particelle magnetiche lentivirali e i campi magnetici possono essere approcci preziosi per migliorare il targeting del vettore genetico e i livelli di trasduzione nelle vie aeree conduttive in vivo.
La fibrosi cistica (CF) è causata da variazioni in un singolo gene chiamato regolatore della conduttanza transmembrana della CF (CFTR).La proteina CFTR è un canale ionico presente in molte cellule epiteliali in tutto il corpo, comprese le vie aeree, un sito importante nella patogenesi della fibrosi cistica.Difetti del CFTR portano a un trasporto anomalo dell'acqua, alla disidratazione della superficie delle vie aeree e alla diminuzione della profondità dello strato fluido superficiale delle vie aeree (ASL).Inoltre compromette la capacità del sistema di trasporto mucociliare (MCT) di liberare le vie aeree dalle particelle e dagli agenti patogeni inalati.Il nostro obiettivo è sviluppare una terapia genica lentivirale (LV) per fornire la copia corretta del gene CFTR e migliorare la salute dell’ASL, dell’MCT e dei polmoni e continuare a sviluppare nuove tecnologie in grado di misurare questi parametri in vivo1.
I vettori LV sono uno dei principali candidati per la terapia genica della fibrosi cistica, principalmente perché possono integrare in modo permanente il gene terapeutico nelle cellule basali delle vie aeree (cellule staminali delle vie aeree).Questo è importante perché possono ripristinare la normale idratazione e la rimozione del muco differenziandosi in cellule superficiali delle vie aeree corrette geneticamente e funzionali associate alla fibrosi cistica, con conseguenti benefici per tutta la vita.I vettori LV devono essere diretti contro le vie aeree conduttrici, poiché è qui che inizia il coinvolgimento polmonare nella FC.Il rilascio del vettore più in profondità nel polmone può provocare una trasduzione alveolare, ma ciò non ha alcun effetto terapeutico nella fibrosi cistica.Tuttavia, i fluidi come i trasportatori dei geni migrano naturalmente negli alveoli quando vengono inalati dopo il parto3,4 e le particelle terapeutiche vengono rapidamente espulse nella cavità orale dagli MCT.L'efficienza della trasduzione del LV è direttamente correlata al periodo di tempo in cui il vettore rimane vicino alle cellule bersaglio per consentire l'assorbimento cellulare - "tempo di residenza" 5 che può essere facilmente ridotto dal tipico flusso d'aria regionale e dall'assorbimento coordinato di muco e particelle MCT.Per la fibrosi cistica, la capacità di prolungare il tempo di permanenza del ventricolo sinistro nelle vie aeree è importante per raggiungere elevati livelli di trasduzione in quest’area, ma finora si è rivelata impegnativa.
Per superare questo ostacolo, proponiamo che le particelle magnetiche LV (MP) possano aiutare in due modi complementari.Innanzitutto, possono essere guidati da un magnete sulla superficie delle vie aeree per migliorare il targeting e aiutare le particelle portatrici del gene a trovarsi nella giusta area delle vie aeree;e ASL) si spostano nello strato cellulare 6. Le MP sono ampiamente utilizzate come veicoli mirati per la somministrazione di farmaci quando si legano ad anticorpi, farmaci chemioterapici o altre piccole molecole che si attaccano alle membrane cellulari o si legano ai rispettivi recettori sulla superficie cellulare e si accumulano nei siti tumorali in presenza di elettricità statica.Campi magnetici per la terapia del cancro 7. Altri metodi “ipertermici” mirano a uccidere le cellule tumorali riscaldando le MP quando esposte a campi magnetici oscillanti.Il principio della trasfezione magnetica, in cui un campo magnetico viene utilizzato come agente di trasfezione per migliorare il trasferimento del DNA nelle cellule, è comunemente usato in vitro utilizzando una gamma di vettori genetici non virali e virali per linee cellulari difficili da trasdurre ..È stata stabilita l'efficienza della magnetotrasfezione del LV con la somministrazione di MP del LV in vitro in una linea cellulare di epitelio bronchiale umano in presenza di un campo magnetico statico, aumentando l'efficienza della trasduzione di 186 volte rispetto al solo vettore del LV.La MT LV è stata applicata anche a un modello in vitro di fibrosi cistica, in cui la trasfezione magnetica ha aumentato la trasduzione del LV nelle colture con interfaccia aria-liquido di un fattore 20 in presenza di espettorato della fibrosi cistica10.Tuttavia, la magnetotrasfezione d'organo in vivo ha ricevuto relativamente poca attenzione ed è stata valutata solo in pochi studi sugli animali11,12,13,14,15, soprattutto nei polmoni16,17.Tuttavia, le possibilità della trasfezione magnetica nella terapia polmonare nella fibrosi cistica sono chiare.Tan et al.(2020) hanno affermato che “uno studio di validazione sull’efficace rilascio polmonare di nanoparticelle magnetiche aprirà la strada a future strategie di inalazione di CFTR per migliorare i risultati clinici nei pazienti con fibrosi cistica”6.
Il comportamento delle piccole particelle magnetiche sulla superficie delle vie respiratorie in presenza di un campo magnetico applicato è difficile da visualizzare e studiare e pertanto sono scarsamente comprese.In altri studi, abbiamo sviluppato un metodo di imaging a raggi X a contrasto di fase basato sulla propagazione del sincrotrone (PB-PCXI) per l'imaging non invasivo e la quantificazione di piccoli cambiamenti in vivo nella profondità dell'ASL18 e nel comportamento dell'MCT19,20 per misurare direttamente l'idratazione superficiale del canale del gas ed è utilizzato come indicatore precoce dell'efficacia del trattamento.Inoltre, il nostro metodo di punteggio MCT utilizza particelle di diametro pari a 10–35 µm composte da allumina o vetro ad alto indice di rifrazione come marcatori MCT visibili con PB-PCXI21.Entrambi i metodi sono adatti per l'imaging di una vasta gamma di tipi di particelle, comprese le MP.
Grazie all'elevata risoluzione spaziale e temporale, i nostri test ASL e MCT basati su PB-PCXI sono particolarmente adatti per studiare le dinamiche e i modelli comportamentali di particelle singole e sfuse in vivo per aiutarci a comprendere e ottimizzare i metodi di consegna del gene MP.L'approccio che utilizziamo qui si basa sui nostri studi utilizzando la linea di luce SPring-8 BL20B2, in cui abbiamo visualizzato il movimento del fluido dopo la somministrazione di una dose di un vettore fittizio nelle vie aeree nasali e polmonari dei topi per aiutare a spiegare i nostri modelli eterogenei di espressione genica osservati nel nostro gene.studi su animali con una dose di trasporto di 3,4 .
Lo scopo di questo studio era di utilizzare il sincrotrone PB-PCXI per visualizzare i movimenti in vivo di una serie di MP nella trachea di ratti vivi.Questi studi di imaging PB-PCXI sono stati progettati per testare la serie MP, l'intensità del campo magnetico e la posizione per determinarne l'effetto sul movimento degli MP.Abbiamo ipotizzato che un campo magnetico esterno avrebbe aiutato il MF consegnato a rimanere o spostarsi nell'area target.Questi studi ci hanno anche permesso di determinare configurazioni dei magneti che massimizzano la quantità di particelle lasciate nella trachea dopo la deposizione.In una seconda serie di studi, abbiamo mirato a utilizzare questa configurazione ottimale per dimostrare il modello di trasduzione risultante dalla consegna in vivo di LV-MP alle vie aeree del ratto, partendo dal presupposto che la consegna di LV-MP nel contesto del targeting delle vie aeree risulterebbe nell’aumento dell’efficienza di trasduzione del VS..
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dall'Università di Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e dal Comitato etico sugli animali del sincrotrone SPring-8.Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni di ARRIVE.
Tutte le immagini a raggi X sono state scattate sulla linea di luce BL20XU del sincrotrone SPring-8 in Giappone utilizzando una configurazione simile a quella descritta in precedenza21,22.In breve, la scatola sperimentale era situata a 245 m dall'anello di accumulazione del sincrotrone.Per gli studi di imaging delle particelle viene utilizzata una distanza campione-rivelatore di 0,6 m e per gli studi di imaging in vivo di 0,3 m per creare effetti di contrasto di fase.È stato utilizzato un fascio monocromatico con un'energia di 25 keV.Le immagini sono state acquisite utilizzando un trasduttore a raggi X ad alta risoluzione (SPring-8 BM3) accoppiato ad un rilevatore sCMOS.Il trasduttore converte i raggi X in luce visibile utilizzando uno scintillatore spesso 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), che viene poi indirizzato al sensore sCMOS utilizzando un obiettivo del microscopio ×10 (NA 0,3).Il rilevatore sCMOS era un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Giappone) con una dimensione dell'array di 2048 × 2048 pixel e una dimensione dei pixel grezzi di 6,5 × 6,5 µm.Questa impostazione fornisce una dimensione isotropica effettiva dei pixel di 0,51 µm e un campo visivo di circa 1,1 mm × 1,1 mm.La durata dell'esposizione di 100 ms è stata scelta per massimizzare il rapporto segnale-rumore delle particelle magnetiche all'interno e all'esterno delle vie aeree, riducendo al minimo gli artefatti da movimento causati dalla respirazione.Per gli studi in vivo, un otturatore a raggi X veloce è stato posizionato nel percorso dei raggi X per limitare la dose di radiazioni bloccando il fascio di raggi X tra le esposizioni.
Il supporto LV non è stato utilizzato in nessuno studio di imaging SPring-8 PB-PCXI perché la camera di imaging BL20XU non è certificata di livello 2 di biosicurezza.Abbiamo invece selezionato una gamma di MP ben caratterizzati da due fornitori commerciali che coprono una gamma di dimensioni, materiali, concentrazioni di ferro e applicazioni, in primo luogo per comprendere come i campi magnetici influenzano il movimento degli MP nei capillari di vetro, e poi in vie aeree viventi.superficie.La dimensione dell'MP varia da 0,25 a 18 µm ed è costituita da vari materiali (vedere Tabella 1), ma la composizione di ciascun campione, inclusa la dimensione delle particelle magnetiche nell'MP, è sconosciuta.Sulla base dei nostri approfonditi studi MCT 19, 20, 21, 23, 24, ci aspettiamo che le MP fino a 5 µm possano essere viste sulla superficie delle vie aeree tracheali, ad esempio, sottraendo fotogrammi consecutivi per vedere una migliore visibilità del movimento delle MP.Un singolo MP di 0,25 µm è inferiore alla risoluzione del dispositivo di imaging, ma si prevede che PB-PCXI rilevi il loro contrasto volumetrico e il movimento della superficie del liquido su cui sono depositati dopo essere stati depositati.
Campioni per ciascun MP nella tabella.1 è stato preparato in capillari di vetro da 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) con un diametro interno di 0,63 mm.Le particelle corpuscolari sono disponibili in acqua, mentre le particelle CombiMag sono disponibili nel liquido proprietario del produttore.Ciascuna provetta è riempita per metà di liquido (circa 11 µl) e posizionata sul supporto del campione (vedere Figura 1).I capillari di vetro sono stati posizionati rispettivamente orizzontalmente sul tavolo nella camera di imaging e posizionati ai bordi del liquido.Un magnete con guscio di nichel di 19 mm di diametro (28 mm di lunghezza) in terre rare, neodimio, ferro e boro (NdFeB) (N35, cat. n. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una rimanenza di 1,17 T è stato fissato a un tabella di trasferimento separata per ottenere la modifica remota della posizione durante il rendering.L'imaging a raggi X inizia quando il magnete viene posizionato a circa 30 mm sopra il campione e le immagini vengono acquisite a 4 fotogrammi al secondo.Durante l'imaging, il magnete è stato avvicinato al tubo capillare di vetro (a una distanza di circa 1 mm) e quindi spostato lungo il tubo per valutare l'effetto dell'intensità e della posizione del campo.
Una configurazione di imaging in vitro contenente campioni MP in capillari di vetro nella fase di traslazione del campione xy.Il percorso del fascio di raggi X è contrassegnato da una linea tratteggiata rossa.
Una volta stabilita la visibilità in vitro delle MP, un sottoinsieme di esse è stato testato in vivo su ratti albini Wistar selvatici di sesso femminile (~ 12 settimane, ~ 200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Giappone), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Giappone) e butorfanolo 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).I ratti sono stati anestetizzati con la miscela Pharma (Giappone) mediante iniezione intraperitoneale.Dopo l'anestesia, i soggetti sono stati preparati per l'imaging rimuovendo il pelo attorno alla trachea, inserendo un tubo endotracheale (ET; cannula endovenosa da 16 Ga, Terumo BCT) e immobilizzandoli in posizione supina su una piastra per imaging su misura contenente una borsa termica per mantenere la temperatura corporea.22. La lastra di imaging è stata quindi fissata al tavolino del campione nella scatola di imaging con una leggera angolazione per allineare la trachea orizzontalmente sull'immagine a raggi X, come mostrato nella Figura 2a.
(a) Configurazione dell'imaging in vivo nell'unità di imaging SPring-8, percorso del fascio di raggi X contrassegnato da una linea tratteggiata rossa.(b, c) La localizzazione del magnete tracheale è stata eseguita in remoto utilizzando due telecamere IP montate ortogonalmente.Sul lato sinistro dell'immagine sullo schermo, è possibile vedere l'anello di filo che sostiene la testa e la cannula di erogazione installata all'interno del tubo ET.
Un sistema di pompa a siringa telecomandato (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) che utilizzava una siringa di vetro da 100 µl è stato collegato a un tubo PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) utilizzando un ago da 30 Ga.Contrassegnare il tubo per garantire che la punta sia nella posizione corretta nella trachea quando si inserisce il tubo endotracheale.Utilizzando una micropompa, lo stantuffo della siringa è stato rimosso e la punta del tubo è stata immersa nel campione MP da erogare.Il tubo di erogazione caricato è stato quindi inserito nel tubo endotracheale, posizionando la punta nella parte più forte del campo magnetico applicato previsto.L'acquisizione delle immagini è stata controllata utilizzando un rilevatore del respiro collegato alla nostra scatola di temporizzazione basata su Arduino e tutti i segnali (ad esempio, temperatura, respirazione, apertura/chiusura dell'otturatore e acquisizione di immagini) sono stati registrati utilizzando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Durante l'imaging Quando l'alloggiamento non era disponibile, due telecamere IP (Panasonic BB-SC382) sono state posizionate a circa 90° l'una rispetto all'altra e utilizzate per controllare la posizione del magnete rispetto alla trachea durante l'imaging (Figura 2b, c).Per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, è stata acquisita un'immagine per respiro durante il plateau del flusso respiratorio terminale.
Il magnete è collegato al secondo stadio, che può essere posizionato in remoto all'esterno del corpo di imaging.Sono state testate varie posizioni e configurazioni del magnete, tra cui: posizionato ad un angolo di circa 30° sopra la trachea (le configurazioni sono mostrate nelle Figure 2a e 3a);un magnete sopra l'animale e l'altro sotto, con i poli impostati per l'attrazione (Figura 3b)., un magnete sopra l'animale e uno sotto, con i poli impostati per la repulsione (Figura 3c), e un magnete sopra e perpendicolare alla trachea (Figura 3d).Dopo aver impostato l'animale e il magnete e caricato l'MP da testare nella pompa a siringa, erogare una dose di 50 µl ad una velocità di 4 µl/sec dopo l'acquisizione delle immagini.Il magnete viene quindi spostato avanti e indietro lungo o attraverso la trachea continuando ad acquisire immagini.
Configurazione del magnete per l'imaging in vivo (a) un magnete sopra la trachea con un angolo di circa 30°, (b) due magneti configurati per l'attrazione, (c) due magneti configurati per la repulsione, (d) un magnete sopra e perpendicolare alla trachea trachea.L'osservatore guardò dalla bocca ai polmoni attraverso la trachea e il fascio di raggi X passò attraverso il lato sinistro del ratto ed uscì dal lato destro.Il magnete viene spostato lungo la lunghezza delle vie aeree oppure a sinistra e a destra sopra la trachea nella direzione del fascio di raggi X.
Abbiamo anche cercato di determinare la visibilità e il comportamento delle particelle nelle vie aeree in assenza di miscelazione tra respirazione e frequenza cardiaca.Pertanto, al termine del periodo di imaging, gli animali sono stati sottoposti ad eutanasia a causa di overdose di pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Alcuni animali sono stati lasciati sulla piattaforma di imaging e, dopo la cessazione della respirazione e del battito cardiaco, il processo di imaging è stato ripetuto, aggiungendo un'ulteriore dose di MP se non era visibile alcun MP sulla superficie delle vie aeree.
Le immagini risultanti sono state corrette per il campo piatto e scuro e quindi assemblate in un filmato (20 fotogrammi al secondo; 15–25 volte la velocità normale a seconda della frequenza respiratoria) utilizzando uno script personalizzato scritto in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tutti gli studi sulla consegna del vettore del gene LV sono stati condotti presso il Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'Università di Adelaide e miravano a utilizzare i risultati dell'esperimento SPring-8 per valutare se la consegna di LV-MP in presenza di un campo magnetico potesse migliorare il trasferimento genico in vivo .Per valutare gli effetti della MF e del campo magnetico, sono stati trattati due gruppi di animali: a un gruppo è stato iniettato MF LV con posizionamento del magnete e all'altro gruppo è stato iniettato un gruppo di controllo con MF LV senza magnete.
I vettori del gene LV sono stati generati utilizzando i metodi precedentemente descritti 25, 26.Il vettore LacZ esprime un gene della beta-galattosidasi localizzato nel nucleo guidato dal promotore costitutivo dell'MPSV (LV-LacZ), che produce un prodotto di reazione blu nelle cellule trasdotte, visibile sui fronti e sulle sezioni del tessuto polmonare.La titolazione è stata eseguita in colture cellulari contando manualmente il numero di cellule LacZ-positive utilizzando un emocitometro per calcolare il titolo in TU/ml.I carrier vengono crioconservati a -80°C, scongelati prima dell'uso e legati a CombiMag mediante miscelazione 1:1 e incubazione su ghiaccio per almeno 30 minuti prima della consegna.
Ratti Sprague Dawley normali (n = 3/gruppo, ~2-3 ip anestetizzati con una miscela di 0,4 mg/kg di medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) e 60 mg/kg di ketamina (Ilium, Australia) a 1 mese di età) ip ) iniezione e incannulamento orale non chirurgico con una cannula endovenosa da 16 Ga.Per garantire che il tessuto delle vie aeree tracheali riceva la trasduzione del ventricolo sinistro, è stato condizionato utilizzando il nostro protocollo di perturbazione meccanica precedentemente descritto in cui la superficie delle vie aeree tracheali è stata strofinata assialmente con un cestello metallico (N-Circle, estrattore di calcoli di nitinol senza punta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Quindi, circa 10 minuti dopo la perturbazione nella cabina di biosicurezza, è stata eseguita la somministrazione tracheale di LV-MP.
Il campo magnetico utilizzato in questo esperimento è stato configurato in modo simile a uno studio a raggi X in vivo, con gli stessi magneti tenuti sulla trachea con morsetti dello stent di distillazione (Figura 4).Un volume di 50 µl (aliquote da 2 x 25 µl) di LV-MP è stato somministrato alla trachea (n = 3 animali) utilizzando una pipetta con punta in gel come descritto in precedenza.Il gruppo di controllo (n = 3 animali) ha ricevuto lo stesso LV-MP senza l'uso di un magnete.Al termine dell'infusione, la cannula viene rimossa dal tubo endotracheale e l'animale viene estubato.Il magnete rimane in sede per 10 minuti prima di essere rimosso.Ai ratti è stato somministrato per via sottocutanea meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguito dalla sospensione dell'anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 1 mg/kg di atipamazolo cloridrato (Antisedan, Zoetis, Australia).I ratti sono stati tenuti al caldo e osservati fino al completo recupero dall'anestesia.
Dispositivo di somministrazione LV-MP in una cappa di sicurezza biologica.Si può vedere che il manicotto Luer-lock grigio chiaro del tubo ET sporge dalla bocca e la punta della pipetta in gel mostrata nella figura viene inserita attraverso il tubo ET alla profondità desiderata nella trachea.
Una settimana dopo la procedura di somministrazione di LV-MP, gli animali sono stati sacrificati in modo umanitario mediante inalazione di CO2 al 100% e l'espressione di LacZ è stata valutata utilizzando il nostro trattamento X-gal standard.I tre anelli cartilaginei più caudali sono stati rimossi per garantire che eventuali danni meccanici o ritenzione di liquidi dovuti al posizionamento del tubo endotracheale non venissero inclusi nell'analisi.Ciascuna trachea è stata tagliata longitudinalmente per ottenere due metà per l'analisi e posta in una tazza contenente gomma siliconica (Sylgard, Dow Inc) utilizzando un ago Minutien (Fine Science Tools) per visualizzare la superficie luminale.La distribuzione e il carattere delle cellule trasdotte sono stati confermati mediante fotografia frontale utilizzando un microscopio Nikon (SMZ1500) con una fotocamera DigiLite e il software TCapture (Tucsen Photonics, Cina).Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento di 20x (inclusa l'impostazione massima per l'intera larghezza della trachea), con l'intera lunghezza della trachea visualizzata passo dopo passo, fornendo una sovrapposizione sufficiente tra ciascuna immagine per consentire la “cucitura” delle immagini.Le immagini di ciascuna trachea sono state quindi combinate in un'unica immagine composita utilizzando Composite Image Editor versione 2.0.3 (Microsoft Research) utilizzando l'algoritmo di movimento planare. L'area dell'espressione LacZ all'interno delle immagini composite tracheali di ciascun animale è stata quantificata utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come descritto in precedenza28, utilizzando impostazioni di 0,35 < Tonalità < 0,58, Saturazione > 0,15 e Valore < 0,7. L'area dell'espressione LacZ all'interno delle immagini composite tracheali di ciascun animale è stata quantificata utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto28, utilizzando impostazioni di 0,35 < Tonalità < 0,58, Saturazione > 0,15 e Valore < 0,7. L'espressione di LacZ è stata utilizzata nei percorsi di visualizzazione di ogni tipo di stampante con l'interfaccia utente è stato creato uno scenario automatico MATLAB (R2020a, MathWorks), come indicato nel programma 28, con l'utilizzo del parametro 0,35 <lettera <0,58, valore> 0,15 e valore <0 ,7. L'area dell'espressione di LacZ nelle immagini tracheali composite di ciascun animale è stata quantificata utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto28 utilizzando impostazioni di 0,350,15 e valore <0,7.Questo è il programma per MATLAB (R2020a, MathWorks) per l'aggiornamento a LacZ量化,使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置.Come usare Matlab per Mathworks量化, 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 、。。。。。 .................... ANCA L'espressione dell'espressione LacZ sui percorsi di immagine costanti è stata gestita con successo è uno scenario automatizzato MATLAB (R2020a, MathWorks), come descritto, con l'utilizzo del valore 0,35 <0,58, in uscita ь> 0,15 e valore <0,7 . Le aree di espressione LacZ sulle immagini composite della trachea di ciascun animale sono state quantificate utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto utilizzando impostazioni di 0,35 < tonalità < 0,58, saturazione > 0,15 e valore < 0,7.Tracciando i contorni dei tessuti in GIMP v2.10.24, è stata creata manualmente una maschera per ciascuna immagine composita per identificare l'area del tessuto e prevenire eventuali falsi rilevamenti all'esterno del tessuto tracheale.Le aree colorate di tutte le immagini composite di ciascun animale sono state sommate per ottenere l'area colorata totale per quell'animale.L'area dipinta è stata poi divisa per l'area totale della maschera per ottenere un'area normalizzata.
Ciascuna trachea è stata inclusa in paraffina e sezionata con uno spessore di 5 µm.Le sezioni sono state controcolorate con rosso neutro veloce per 5 minuti e le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Nikon Eclipse E400, una fotocamera DS-Fi3 e un software di acquisizione degli elementi NIS (versione 5.20.00).
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).La significatività statistica è stata fissata a p ≤ 0,05.La normalità è stata testata utilizzando il test Shapiro-Wilk e le differenze nella colorazione LacZ sono state valutate utilizzando un t-test per dati non appaiati.
I sei MP descritti nella Tabella 1 sono stati esaminati dal PCXI e la visibilità è descritta nella Tabella 2. Due MP di polistirene (MP1 e MP2; 18 µm e 0,25 µm, rispettivamente) non erano visibili dal PCXI, ma i restanti campioni sono stati identificati (gli esempi sono mostrati nella Figura 5).MP3 e MP4 sono debolmente visibili (10-15% Fe3O4; 0,25 µm e 0,9 µm, rispettivamente).Sebbene MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contenesse alcune delle particelle più piccole testate, era la più pronunciata.Il prodotto CombiMag MP6 è difficile da distinguere.In tutti i casi, la nostra capacità di rilevare MF è stata notevolmente migliorata spostando il magnete avanti e indietro parallelamente al capillare.Quando i magneti si allontanavano dal capillare, le particelle venivano estratte in lunghe catene, ma quando i magneti si avvicinavano e l'intensità del campo magnetico aumentava, le catene di particelle si accorciavano mentre le particelle migravano verso la superficie superiore del capillare (vedere Video supplementare S1 : MP4), aumentando la densità delle particelle in superficie.Al contrario, quando il magnete viene rimosso dal capillare, l'intensità del campo diminuisce e le MP si riorganizzano in lunghe catene che si estendono dalla superficie superiore del capillare (vedere Video supplementare S2: MP4).Dopo che il magnete smette di muoversi, le particelle continuano a muoversi per qualche tempo dopo aver raggiunto la posizione di equilibrio.Quando l'MP si avvicina e si allontana dalla superficie superiore del capillare, le particelle magnetiche tendono ad attirare i detriti attraverso il liquido.
La visibilità di MP sotto PCXI varia considerevolmente tra i campioni.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Tutte le immagini mostrate qui sono state scattate con un magnete posizionato a circa 10 mm direttamente sopra il capillare.I grandi cerchi apparenti sono bolle d'aria intrappolate nei capillari, che mostrano chiaramente le caratteristiche dei bordi bianco e nero dell'immagine a contrasto di fase.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che migliora il contrasto.Si noti che i diametri dei circuiti magnetici in tutte le figure non sono in scala e sono circa 100 volte più grandi di quanto mostrato.
Mentre il magnete si sposta a sinistra e a destra lungo la parte superiore del capillare, l'angolo della corda MP cambia per allinearsi al magnete (vedere Figura 6), delineando così le linee del campo magnetico.Per MP3-5, dopo che la corda raggiunge l'angolo di soglia, le particelle si trascinano lungo la superficie superiore del capillare.Ciò spesso fa sì che gli MP si raggruppino in gruppi più grandi vicino al punto in cui il campo magnetico è più forte (vedi Video supplementare S3: MP5).Ciò è particolarmente evidente anche quando si esegue l'imaging vicino all'estremità del capillare, che fa sì che l'MP si aggreghi e si concentri sull'interfaccia liquido-aria.Le particelle nell'MP6, che erano più difficili da distinguere rispetto a quelle nell'MP3-5, non si trascinavano quando il magnete si muoveva lungo il capillare, ma le stringhe MP si dissociavano, lasciando le particelle in vista (vedi Video supplementare S4: MP6).In alcuni casi, quando il campo magnetico applicato veniva ridotto spostando il magnete a lunga distanza dal sito di imaging, eventuali MP rimanenti scendevano lentamente sulla superficie inferiore del tubo per gravità, rimanendo nella corda (vedere Video supplementare S5: MP3) .
L'angolo della corda MP cambia quando il magnete si sposta a destra sopra il capillare.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che migliora il contrasto.Tieni presente che i video aggiuntivi sono a scopo informativo poiché rivelano importanti informazioni sulla struttura delle particelle e dinamiche che non possono essere visualizzate in queste immagini statiche.
I nostri test hanno dimostrato che spostare lentamente il magnete avanti e indietro lungo la trachea facilita la visualizzazione della MF nel contesto di movimenti complessi in vivo.Non sono stati eseguiti test in vivo perché le perle di polistirene (MP1 e MP2) non erano visibili nel capillare.Ciascuno dei restanti quattro MF è stato testato in vivo con l'asse lungo del magnete posizionato sopra la trachea con un angolo di circa 30° rispetto alla verticale (vedere Figure 2b e 3a), poiché ciò ha prodotto catene MF più lunghe ed è stato più efficace più di un magnete..configurazione terminata.MP3, MP4 e MP6 non sono stati trovati nella trachea di nessun animale vivo.Quando si visualizzava il tratto respiratorio dei ratti dopo aver ucciso gli animali con metodi umanitari, le particelle rimanevano invisibili anche quando veniva aggiunto ulteriore volume utilizzando una pompa a siringa.MP5 aveva il più alto contenuto di ossido di ferro ed era l'unica particella visibile, quindi è stata utilizzata per valutare e caratterizzare il comportamento di MP in vivo.
Il posizionamento del magnete sulla trachea durante l'inserimento della MF ha comportato la concentrazione di molte MF, ma non di tutte, nel campo visivo.L'ingresso tracheale di particelle si osserva meglio negli animali sottoposti ad eutanasia.Figura 7 e video supplementare S6: MP5 mostra la rapida cattura magnetica e l'allineamento delle particelle sulla superficie della trachea ventrale, indicando che gli MP possono essere mirati alle aree desiderate della trachea.Durante la ricerca più distale lungo la trachea dopo l'erogazione di MF, alcuni MF sono stati trovati più vicini alla carena, il che indica un'intensità del campo magnetico insufficiente per raccogliere e trattenere tutti gli MF, poiché sono stati erogati attraverso la regione di massima intensità del campo magnetico durante la somministrazione di liquidi.processi.Tuttavia, le concentrazioni di MP postnatali erano più elevate intorno all’area dell’immagine, suggerendo che molti MP rimanevano nelle regioni delle vie aeree dove l’intensità del campo magnetico applicato era massima.
Immagini di (a) prima e (b) dopo la somministrazione di MP5 nella trachea di un ratto recentemente soppresso con un magnete posizionato appena sopra l'area di imaging.L'area raffigurata si trova tra due anelli cartilaginei.C'è del fluido nelle vie aeree prima che venga erogato il MP.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che migliora il contrasto.Queste immagini sono tratte dal video presente in S6: MP5 Supplementary Video.
Lo spostamento del magnete lungo la trachea in vivo ha comportato un cambiamento nell'angolo della catena MP sulla superficie delle vie aeree, simile a quello osservato nei capillari (vedere Figura 8 e Video supplementare S7: MP5).Tuttavia, nel nostro studio, le MP non potevano essere trascinate lungo la superficie delle vie respiratorie viventi, come potrebbero fare i capillari.In alcuni casi, la catena MP si allunga man mano che il magnete si sposta a destra e a sinistra.È interessante notare che abbiamo anche scoperto che la catena di particelle cambia la profondità dello strato superficiale del fluido quando il magnete viene spostato longitudinalmente lungo la trachea e si espande quando il magnete viene spostato direttamente sopra la testa e la catena di particelle viene ruotata in una posizione verticale (vedi Video supplementare S7).: MP5 alle 0:09, in basso a destra).Il caratteristico schema di movimento cambiava quando il magnete veniva spostato lateralmente attraverso la parte superiore della trachea (cioè a sinistra oa destra dell'animale, anziché lungo la lunghezza della trachea).Le particelle erano ancora chiaramente visibili durante il loro movimento, ma quando il magnete veniva rimosso dalla trachea, le punte delle stringhe di particelle diventavano visibili (vedi Video supplementare S8: MP5, a partire da 0:08).Ciò concorda con il comportamento osservato del campo magnetico sotto l'azione di un campo magnetico applicato in un capillare di vetro.
Immagini di esempio che mostrano MP5 nella trachea di un ratto vivo anestetizzato.(a) Il magnete viene utilizzato per acquisire immagini sopra e a sinistra della trachea, quindi (b) dopo aver spostato il magnete a destra.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che migliora il contrasto.Queste immagini provengono dal video presente nel video supplementare di S7: MP5.
Quando i due poli erano sintonizzati in un orientamento nord-sud sopra e sotto la trachea (cioè attraendo; Fig. 3b), le corde MP apparivano più lunghe e si trovavano sulla parete laterale della trachea piuttosto che sulla superficie dorsale della trachea. trachea (vedi Appendice).Video S9:MP5).Tuttavia, elevate concentrazioni di particelle in un sito (vale a dire, la superficie dorsale della trachea) non sono state rilevate dopo la somministrazione di liquidi utilizzando un dispositivo a doppio magnete, cosa che solitamente avviene con un dispositivo a magnete singolo.Quindi, quando un magnete è stato configurato per respingere i poli opposti (Figura 3c), il numero di particelle visibili nel campo visivo non è aumentato dopo la consegna.L'impostazione di entrambe le configurazioni dei magneti è impegnativa a causa dell'elevata intensità del campo magnetico che attrae o spinge rispettivamente i magneti.La configurazione è stata quindi modificata in un singolo magnete parallelo alle vie aeree ma che passa attraverso le vie aeree con un angolo di 90 gradi in modo che le linee di forza attraversassero ortogonalmente la parete tracheale (Figura 3d), un orientamento inteso a determinare la possibilità di aggregazione delle particelle su la parete laterale.essere osservato.Tuttavia, in questa configurazione, non vi era alcun movimento di accumulo MF identificabile o movimento del magnete.Sulla base di tutti questi risultati, per gli studi in vivo sui portatori di geni è stata scelta una configurazione con un singolo magnete e un orientamento di 30 gradi (Fig. 3a).
Quando l'animale è stato ripreso più volte subito dopo essere stato sacrificato umanamente, l'assenza di movimento interferente del tessuto ha fatto sì che si potessero distinguere linee di particelle più sottili e più corte nel campo intercartilagineo chiaro, che "oscillavano" in conformità con il movimento di traslazione del magnete.vedere chiaramente la presenza e il movimento delle particelle MP6.
Il titolo di LV-LacZ era 1,8 x 108 UI/ml e, dopo aver miscelato 1:1 con CombiMag MP (MP6), agli animali sono stati iniettati 50 µl di una dose tracheale di 9 x 107 UI/ml di veicolo LV (ovvero 4,5 x 106 TU/ratto).).).In questi studi, invece di spostare il magnete durante il travaglio, abbiamo fissato il magnete in una posizione per determinare se la trasduzione del ventricolo sinistro potesse (a) essere migliorata rispetto alla somministrazione del vettore in assenza di un campo magnetico e (b) se le vie aeree potessero essere concentrato.Le cellule vengono trasdotte nelle aree bersaglio magnetiche del tratto respiratorio superiore.
La presenza di magneti e l’uso di CombiMag in combinazione con vettori LV non sembravano avere effetti negativi sulla salute degli animali, così come il nostro protocollo standard di somministrazione dei vettori LV.Le immagini frontali della regione tracheale sottoposta a perturbazione meccanica (Figura 1 supplementare) hanno mostrato che il gruppo trattato con LV-MP aveva livelli di trasduzione significativamente più elevati in presenza di un magnete (Figura 9a).Nel gruppo di controllo era presente solo una piccola quantità di colorazione blu LacZ (Figura 9b).La quantificazione delle regioni normalizzate colorate con X-Gal ha mostrato che la somministrazione di LV-MP in presenza di un campo magnetico ha comportato un miglioramento di circa 6 volte (Fig. 9c).
Esempio di immagini composite che mostrano la trasduzione tracheale con LV-MP (a) in presenza di un campo magnetico e (b) in assenza di un magnete.(c) Miglioramento statisticamente significativo dell'area normalizzata della trasduzione di LacZ nella trachea con l'uso di un magnete (*p = 0,029, t-test, n = 3 per gruppo, media ± errore standard della media).
Le sezioni neutre colorate in rosso veloce (esempio mostrato nella Figura 2 supplementare) indicavano che le cellule colorate con LacZ erano presenti nello stesso campione e nella stessa posizione come riportato in precedenza.
La sfida chiave nella terapia genica delle vie aeree rimane la localizzazione precisa delle particelle portatrici nelle aree di interesse e il raggiungimento di un elevato livello di efficienza di trasduzione nel polmone mobile in presenza di flusso d’aria e di clearance attiva del muco.Per i portatori LV destinati al trattamento delle malattie respiratorie nella fibrosi cistica, l'aumento del tempo di permanenza delle particelle dei portatori nelle vie aeree conduttrici è stato finora un obiettivo irraggiungibile.Come sottolineato da Castellani et al., l'uso di campi magnetici per migliorare la trasduzione presenta vantaggi rispetto ad altri metodi di consegna genica come l'elettroporazione perché può combinare semplicità, economia, consegna localizzata, maggiore efficienza e tempi di incubazione più brevi.ed eventualmente una dose inferiore di veicolo10.Tuttavia, la deposizione in vivo e il comportamento delle particelle magnetiche nelle vie aeree sotto l’influenza di forze magnetiche esterne non sono mai stati descritti, e infatti la capacità di questo metodo di aumentare i livelli di espressione genica nelle vie aeree viventi intatte non è stata dimostrata in vivo.
I nostri esperimenti in vitro sul sincrotrone PCXI hanno mostrato che tutte le particelle che abbiamo testato, ad eccezione del polistirene MP, erano visibili nella configurazione di imaging che abbiamo utilizzato.In presenza di un campo magnetico, i campi magnetici formano delle stringhe, la cui lunghezza è correlata al tipo di particelle e all'intensità del campo magnetico (cioè alla vicinanza e al movimento del magnete).Come mostrato nella Figura 10, le stringhe che osserviamo si formano quando ogni singola particella si magnetizza e induce il proprio campo magnetico locale.Questi campi separati fanno sì che altre particelle simili si raccolgano e si connettano con i movimenti di gruppo delle stringhe dovuti alle forze locali delle forze locali di attrazione e repulsione di altre particelle.
Diagramma che mostra (a, b) catene di particelle che si formano all'interno di capillari pieni di liquido e (c, d) una trachea piena d'aria.Si noti che i capillari e la trachea non sono disegnati in scala.Il pannello (a) contiene anche una descrizione del MF contenente particelle Fe3O4 disposte in catene.
Quando il magnete si è spostato sul capillare, l'angolo della stringa di particelle ha raggiunto la soglia critica per MP3-5 contenente Fe3O4, dopodiché la stringa di particelle non è più rimasta nella sua posizione originale, ma si è spostata lungo la superficie in una nuova posizione.magnete.Questo effetto probabilmente si verifica perché la superficie del capillare di vetro è sufficientemente liscia da consentire questo movimento.È interessante notare che MP6 (CombiMag) non si è comportato in questo modo, forse perché le particelle erano più piccole, avevano un rivestimento o una carica superficiale diversa, oppure il fluido vettore proprietario ne influenzava la capacità di muoversi.Anche il contrasto nell'immagine delle particelle di CombiMag è più debole, suggerendo che il liquido e le particelle potrebbero avere la stessa densità e quindi non possono muoversi facilmente l'uno verso l'altro.Le particelle possono anche rimanere intrappolate se il magnete si muove troppo velocemente, indicando che l'intensità del campo magnetico non può sempre superare l'attrito tra le particelle nel fluido, suggerendo che l'intensità del campo magnetico e la distanza tra il magnete e l'area bersaglio non dovrebbero essere un problema. sorpresa.importante.Questi risultati indicano anche che, sebbene i magneti possano catturare molte microparticelle che fluiscono attraverso l’area target, è improbabile che si possa fare affidamento sui magneti per spostare le particelle CombiMag lungo la superficie della trachea.Pertanto, abbiamo concluso che gli studi in vivo sulla MF del ventricolo sinistro dovrebbero utilizzare campi magnetici statici per colpire fisicamente aree specifiche dell’albero delle vie aeree.
Una volta che le particelle vengono immesse nel corpo, sono difficili da identificare nel contesto del complesso tessuto in movimento del corpo, ma la loro capacità di rilevamento è stata migliorata spostando il magnete orizzontalmente sulla trachea per “muovere” le corde MP.Sebbene sia possibile l’imaging in tempo reale, è più facile discernere il movimento delle particelle dopo che l’animale è stato ucciso con metodi umanitari.Le concentrazioni di MP erano solitamente più alte in questa posizione quando il magnete era posizionato sopra l'area di imaging, sebbene alcune particelle fossero solitamente trovate più in basso nella trachea.A differenza degli studi in vitro, le particelle non possono essere trascinate lungo la trachea dal movimento di un magnete.Questa scoperta è coerente con il modo in cui il muco che ricopre la superficie della trachea elabora tipicamente le particelle inalate, intrappolandole nel muco e successivamente eliminandole attraverso il meccanismo di pulizia muco-ciliare.
Abbiamo ipotizzato che l'uso di magneti sopra e sotto la trachea per l'attrazione (Fig. 3b) potrebbe comportare un campo magnetico più uniforme, piuttosto che un campo magnetico altamente concentrato in un punto, con conseguente potenziale distribuzione più uniforme delle particelle..Tuttavia, il nostro studio preliminare non ha trovato prove chiare a sostegno di questa ipotesi.Allo stesso modo, l'impostazione di una coppia di magneti per la repulsione (Fig. 3c) non ha comportato una maggiore sedimentazione delle particelle nell'area dell'immagine.Questi due risultati dimostrano che la configurazione a doppio magnete non migliora significativamente il controllo locale del puntamento MP e che le forti forze magnetiche risultanti sono difficili da regolare, rendendo questo approccio meno pratico.Allo stesso modo, anche l'orientamento del magnete sopra e attraverso la trachea (Figura 3d) non ha aumentato il numero di particelle rimanenti nell'area sottoposta a imaging.Alcune di queste configurazioni alternative potrebbero non avere successo poiché determinano una riduzione dell'intensità del campo magnetico nella zona di deposizione.Pertanto, la configurazione a magnete singolo a 30 gradi (Fig. 3a) è considerata il metodo di test in vivo più semplice ed efficiente.
Lo studio LV-MP ha dimostrato che quando i vettori LV venivano combinati con CombiMag e consegnati dopo essere stati fisicamente disturbati dalla presenza di un campo magnetico, i livelli di trasduzione aumentavano significativamente nella trachea rispetto ai controlli.Sulla base degli studi di imaging al sincrotrone e dei risultati di LacZ, il campo magnetico sembrava essere in grado di mantenere il ventricolo sinistro nella trachea e di ridurre il numero di particelle vettori che penetravano immediatamente in profondità nel polmone.Tali miglioramenti del targeting possono portare a una maggiore efficienza riducendo al contempo i titoli consegnati, la trasduzione non mirata, gli effetti collaterali infiammatori e immunitari e i costi di trasferimento genico.È importante sottolineare che, secondo il produttore, CombiMag può essere utilizzato in combinazione con altri metodi di trasferimento genico, inclusi altri vettori virali (come AAV) e acidi nucleici.