Giardia duodeno è un organismo parassita che causa la giardiasi, un'infezione intestinale particolarmente comune nei bambini piccoli con segni clinici di diarrea.Abbiamo precedentemente segnalato che G. duodenalis extracellulare innesca l'attivazione dei nucleotidi leganti il ​​recettore 3 simile all'oligomerizzazione intracellulare (NLRP3) e regola le risposte infiammatorie dell'ospite attraverso la secrezione di vescicole extracellulari (EV).Tuttavia, gli esatti modelli molecolari dell'EV duodenococcico associato al patogeno (GEV) coinvolto in questo processo e il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nella giardiasi rimangono da chiarire.
I plasmidi ricombinanti di espressione eucariotica pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardine in GEV sono stati costruiti, trasfettati in macrofagi peritoneali primari di topo e rilevati misurando la molecola bersaglio dell'infiammazione caspasi-1.È stato selezionato il livello di espressione di p20..Le giardine di G. duodenalis alfa-2 e alfa-7.3 sono state originariamente identificate misurando l'inflammasoma NLRP3 (NLRP3, pro-interleuchina-1 beta [IL-1β], pro-caspasi-1 e caspasi-1 p20), la secrezione di IL.Livelli di 1β, livelli di oligomerizzazione della proteina apoptotica macchiata (ASC) e localizzazione immunofluorescente di NLRP3 e ASC.Il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nella patogenicità di G. duodenalis è stato quindi valutato utilizzando topi in cui l'attivazione di NLRP3 era bloccata (topi bloccati NLRP3) e sono stati monitorati i cambiamenti patologici nel peso corporeo, nel carico parassitario duodenale e nel tessuto duodenale.Inoltre, abbiamo studiato se le iardine alfa-2 e alfa-7.3 inducono la secrezione di IL-1β in vivo tramite l'inflammasoma NLRP3 e abbiamo determinato il ruolo di queste molecole nella patogenicità di G. duodenalis nei topi.
Le giardine alfa-2 e alfa-7.3 inducono l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in vitro.Ciò ha portato all'attivazione della caspasi-1 p20, ad un aumento dei livelli di espressione delle proteine ​​NLRP3, pro-IL-1β e pro-caspasi-1, ad un aumento significativo della secrezione di IL-1β, alla formazione di macchie ASA nel citoplasma e l'induzione dell'oligomerizzazione dell'ASA.Infiammazione NLRP3 La perdita del pene aggrava la patogenicità di G. duodenalis nei topi.Topi trattati con cisti mediante sonda gastrica da topi bloccati con NLRP3 hanno mostrato un aumento del numero di trofozoiti e gravi danni ai villi duodenali, caratterizzati da cripte necrotiche con restringimento e ramificazione.Esperimenti in vivo hanno dimostrato che le giardine alfa-2 e alfa-7.3 possono indurre la secrezione di IL-1β tramite l'inflammasoma NLRP3 e l'immunizzazione con giardine alfa-2 e alfa-7.3 ha ridotto la patogenicità di G. duodenalis nei topi.
Presi insieme, i risultati di questo studio suggeriscono che giardia alfa-2 e alfa-7.3 causano una sovraregolazione dell'infiammazione NLRP3 dell'ospite e riducono l'infettività di G. duodenalis nei topi, che sono obiettivi promettenti per prevenire la giardiasi.
Giardia duodeno è un protozoo parassita extracellulare che vive nell’intestino tenue e causa ogni anno 280 milioni di casi di giardiasi con diarrea, soprattutto tra i bambini piccoli nei paesi in via di sviluppo [1].Le persone si infettano bevendo acqua o alimenti contaminati da cisti di M. duodenum, che poi entrano nello stomaco e vengono escrete nei succhi gastrici.I trofozoiti di Giardia duodeno si attaccano all'epitelio duodenale, causando nausea, vomito, diarrea, dolore addominale e perdita di peso.Gli individui con immunodeficienza e fibrosi cistica sono suscettibili alle infezioni.L’infezione può avvenire anche attraverso il sesso orale e anale [2].Farmaci come metronidazolo, tinidazolo e nitazoxanide sono le opzioni terapeutiche preferite per le infezioni duodenali [3].Tuttavia, questi farmaci chemioterapici causano effetti collaterali avversi come nausea, cancerogenesi e genotossicità [4].Pertanto, è necessario sviluppare strategie più efficaci per prevenire l’infezione da G. duodenalis.
Gli inflammasomi sono una classe di complessi proteici citosolici che fanno parte della risposta immunitaria innata, aiutando a difendersi dall’invasione di agenti patogeni e a mediare le risposte infiammatorie [5].Tra questi inflammasomi, l'inflammasoma simile al legame dei nucleotidi (NLRP3), oligomerizzazione legante i nucleotidi (NOD) recettore 3 (NLRP3), oligomerizzazione legante i nucleotidi (NLRP3) è stato ampiamente studiato perché può essere rilevato da vari modelli molecolari associati a patogeni/danni (PAMP/ DAMP), riconosce, attiva il sistema immunitario innato.e regola l’omeostasi intestinale in molte malattie infiammatorie [6,7,8].È costituito dal recettore per il riconoscimento del pattern (PRR) NLRP3, da una proteina adattatrice apoptotica spottata (ASC) e da un effettore procaspasi-1 o procaspasi-11.L'inflammasoma NLRP3 agisce come ospite contro l'invasione dei patogeni, come osservato negli studi su Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] e Leishmania.[11], ma è stato anche riportato che l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 limita le risposte immunitarie protettive ed esacerba la progressione della malattia, ad esempio nei vermi [12].Sulla base dei nostri risultati precedenti, abbiamo riportato che G. duodenalis extracellulare innesca l'attivazione intracellulare dell'infiammazione NLRP3 e modula le risposte infiammatorie dell'ospite secernendo vescicole extracellulari (EV) [13].Tuttavia, resta da determinare il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nell'infezione da G. duodenalis in vivo.
I giardin sono stati originariamente descritti come componenti strutturali del citoscheletro di G. duodenalis e svolgono un ruolo importante nella motilità dei trofozoiti e nell'attaccamento delle cellule epiteliali nell'intestino tenue.Per adattarsi meglio all'ambiente e aumentare la loro patogenicità, i trofozoiti di G. duodenalis hanno sviluppato una struttura citoscheletrica unica composta da 8 flagelli, 1 corpo medio e 1 disco ventrale [14].I trofozoiti di Giardia duodeno utilizzano il loro citoscheletro per penetrare nella parte superiore dell'intestino tenue, in particolare nel duodeno, e attaccarsi agli enterociti.Migrano costantemente e si attaccano alle cellule epiteliali utilizzando il metabolismo cellulare.Pertanto, esiste una stretta relazione tra il loro citoscheletro e la virulenza.Le giardine specifiche per Giardia duodeno sono componenti della struttura del citoscheletro [15] e sono divise in quattro classi: α-, β-, γ- e δ-giardine.Ci sono 21 membri della famiglia α-giardin, che hanno tutti una capacità calcio-dipendente di legare i fosfolipidi [16].Collegano anche il citoscheletro alla membrana cellulare.Negli individui con diarrea causata da G. duodenalis, le α-giardine sono altamente espresse e immunoreattive durante l'infezione [17].I vaccini eterologhi basati su Giardia alfa-1 proteggono contro la giardiasi nei topi e sono potenziali antigeni candidati per lo sviluppo di vaccini [18].L'alfa-8 giardina, localizzata nella membrana plasmatica e nei flagelli, ma non nel disco ventrale, migliora la motilità e il tasso di crescita dei trofozoiti in G. duodenalis [19].L'alfa-14 giardina si attacca alle strutture dei microtubuli sui flagelli e influenza la vitalità di G. duodenalis [20].La giardina alfa-11 è presente in abbondanza durante tutto il ciclo di vita e la sovraespressione della giardina alfa-11 danneggia lo stesso G. duodenalis [21].Tuttavia, non è chiaro se la giardina alfa-2 e la giardina alfa-7.3 siano protettive contro l'infezione da G. duodenalis e i loro meccanismi sottostanti.
In questo studio, i plasmidi di espressione eucariotica ricombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina sono stati trasfettati in macrofagi peritoneali primari del topo per attivare l'ospite NLRP3.Sono stati quindi selezionati i bersagli dell'inflammasoma.Abbiamo anche valutato il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nella patogenicità di G. duodenalis, studiato se le giardine alfa-2 e alfa-7,3 inducono l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in vivo e determinato che questi due ruoli delle giardine nella patogenicità di G. duodenalis.Il nostro obiettivo comune era sviluppare obiettivi promettenti per la prevenzione dell’infezione da G. duodenalis.
Topi femmine C57BL/6 di tipo selvatico (WT) di età compresa tra 5 e 8 settimane sono stati acquistati dal Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Cina).I topi avevano libero accesso all'acqua, ricevevano cibo sterilizzato e venivano tenuti in un ciclo luce/buio di 12/12 ore.Prima dell’infezione, i topi hanno ricevuto antibiotici ad libitum nell’acqua potabile integrata con ampicillina (1 mg/ml), vancomicina (1 mg/ml) e neomicina (1,4 mg/ml) (tutti acquistati da Shanghai, Cina, organismi artificiali) [22 ].].I topi che hanno perso la capacità di mangiare e bere per > 24 ore e hanno perso ≥ 20% del peso corporeo sono stati sottoposti ad eutanasia mediante lussazione cervicale.
I trofozoiti di WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) sono stati integrati con il 12,5% di siero bovino fetale (FBS; Every Green, Zhejiang, Cina) e lo 0,1% di bile bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA). ).USA) in condizioni microaerobiche.I trofozoiti confluenti sono stati raccolti su ghiaccio e fatti passare in un rapporto di 1:4 per l'ulteriore riproduzione.
Le cisti di Giardia duodeno sono state indotte come descritto in precedenza [23], i trofozoiti sono stati raccolti in fase logaritmica e quindi diluiti con mezzo inducente l'incapsulamento, pH 7,1 (TYI-S-33 modificato) ad una concentrazione finale di 1 × 106 trofozoiti/mL.concentrazione di bile 0,05% media).I trofozoiti sono stati coltivati ​​in condizioni anaerobiche a 37°C fino alla fase di crescita logaritmica.Cambiare il mezzo in mezzo che induce cisti (pH 7,8; ​​mezzo TYI-S-33 modificato con concentrazione di bile all'1%) e coltivare G. duodenalis a 37°C per 48–96 ore, durante le quali la formazione di cisti è stata osservata al microscopio.Dopo che la maggior parte dei trofozoiti è stata indotta a formare cisti, la miscela di coltura è stata raccolta e risospesa in acqua deionizzata sterile per lisare i restanti trofozoiti.Le cisti sono state contate e conservate a 4°C per le successive analisi attraverso un tubo gastrico nei topi.
Le vescicole extracellulari di Giardia (GEV) sono state arricchite come descritto in precedenza [13].I trofozoiti in fase di crescita logaritmica sono stati risospesi in terreno TYI-S-33 modificato preparato con FBS impoverito di esosomi (Biological Industries, Beit-Haemek, Israele) a una concentrazione finale di 1 × 106 parassiti/mL e incubati per 12 ore.sono stati isolati dal surnatante della coltura mediante centrifugazione a 2000 g per 10 minuti, 10.000 g per 45 minuti e 100.000 g per 60 minuti.I precipitati sono stati sciolti in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quantificati utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e conservati a -80° C. o utilizzati direttamente per ulteriori analisi.
I macrofagi peritoneali primari del topo sono stati preparati come descritto in precedenza [24].In breve, ai topi (di età compresa tra 6 e 8 settimane) sono stati iniettati (intraperitonealmente [ip]) 2,5 ml di mezzo tioglicole liquido Difco al 2,98% (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) e nutriti 3-4 palati.Una sospensione di macrofagi è stata raccolta dalla cavità addominale dei topi dopo l'eutanasia e centrifugata 3 volte a 1000 g per 10 minuti.Le cellule raccolte sono state rilevate mediante citometria a flusso utilizzando il marcatore CD11b fino a quando la purezza cellulare era > 98%, quindi aggiunte a piastre di coltura cellulare da 6 pozzetti (4,5 x 106 cellule/pozzetto) e incubate con FBS al 10% (Bioindustria) a 37°C.e il 5% di CO2.
L'RNA è stato estratto da 1 × 107 trofozoiti in 1 ml di reagente TRIzol (Vazyme, Nanjing, Cina), il DNA genomico è stato estratto dall'RNA totale di G. duodenalis utilizzando MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Cina) ed è stato sintetizzato il DNA complementare (cDNA) utilizzando MonScript RTIIII Super Mix (Monad) secondo le istruzioni del produttore.
Le informazioni sulla sequenza CDS per il gene bersaglio G. duodenalis sono state ottenute dall'NCBI GenBank.Utilizzare Primer 5.0 per progettare primer di clonazione senza soluzione di continuità specifici per ciascun gene bersaglio.Il primer diretto (5′-3′) è costituito da tre parti: una sequenza sovrapposta con un vettore linearizzato pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) e codoni iniziali ATG e GNN (se la prima base non è G).Questo viene fatto per migliorare l'efficienza dell'espressione.Inoltre, almeno 16 bp di basi combinate (contenuto di GC 40–60%/Tm circa 55 °C).Il primer inverso (5′-3′) è costituito da due parti, una sequenza sovrapposta con un vettore linearizzato EcoRV pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) e una base combinata di almeno 16 bp.(escluse le ultime due fermate).basi) un codone come AA o GA per consentire ai plasmidi ricombinanti di esprimere le loro proteine ​​marcate).Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 1 e sono state sintetizzate da Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Cina).
I target sono stati amplificati utilizzando la DNA polimerasi Pfu (Tiangen, Pechino, Cina) o Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pechino, Cina) utilizzando il cDNA di G. duodenalis preparato come modello.Il plasmide del vettore di espressione eucariotica pcDNA3.1(+) è stato linearizzato con l'enzima di restrizione EcoRV e defosforilato utilizzando Fast AP (Thermo Fisher Scientific).I frammenti linearizzati pcDNA3.1(+) e i frammenti del gene bersaglio amplificati sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione del gel di DNA (Tiangen) e quantificati utilizzando un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Il frammento pcDNA3.1(+) e ciascun frammento del gene bersaglio sono stati ricombinati utilizzando la miscela di clonazione a singolo assemblaggio MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Cina) e confermati mediante sequenziamento del DNA utilizzando Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Cina)..
Plasmidi privi di endotossine pcDNA3.1(+)-alfa-2 e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 sono stati generati utilizzando il mini kit plasmide privo di endotossine SanPrep (Sangon Biotech).La concentrazione è stata mantenuta al di sopra di 500 ng/μl per garantire che l'EDTA nel tampone di eluizione non interferisse con il test di trasfezione.I macrofagi peritoneali primari del topo sono stati coltivati ​​in piastre da 6 pozzetti con terreno RPMI 1640 completo (Biological Industries) per 12 ore, quindi le cellule sono state lavate 3 volte in PBS caldo per rimuovere penicillina e streptomicina, e quindi in terreno integrato con terreno completo.Plasmidi privi di endotossine pcDNA3.1(+)-alfa-2 e pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) sono stati diluiti in 125 μl di mezzo sierico ridotto Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Quindi 5 µl di reagente di trasfezione Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) sono stati diluiti in 125 µl di mezzo Opti-MEM a basso contenuto di siero.Preparare i complessi liposoma-DNA mescolando il plasmide diluito privo di endotossine con Lipofectamina 2000 e lasciando riposare la miscela a temperatura ambiente per 5 minuti.Trasferire i complessi separatamente nelle cellule di ciascun pozzetto e mescolare lentamente.Dopo 4 ore, il terreno di coltura cellulare è stato sostituito con 2 ml di terreno RPMI 1640 completo e la coltura è stata continuata per 24 ore.Il terreno di coltura cellulare fresco è stato aggiunto alle cellule e incubato per vari punti temporali a seconda del disegno del test.
I campioni proteici provenienti da surnatanti e lisati cellulari sono stati preparati come descritto in precedenza [25].I parametri di trasferimento di membrana per pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actina e His-tag erano 200 mA/90 min.Per l'interleuchina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspasi-1 (p20) (Adipogen, Svizzera) e NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Svizzera) e 1:5000 mirato al suo tag (Amylet Scientific, Wuhan, Cina) e β-actina (Proteintech, Wuhan, Cina).
La reticolazione con disuccinimide suberato (DSS) è stata eseguita come descritto in precedenza [26].Le cellule sono state lavate 3 volte con PBS freddo e completamente lisate con un ago di calibro 27 in 50 µl di tampone di reazione ASC (pH 8,0) contenente 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES e 125 mM NaHCO3.La miscela è stata centrifugata a 5000 g per 3 minuti e il pellet è stato suturato con 10 µl di DSS (25 mM in DMSO) e 40 µl di tampone di reazione ASC per 30 minuti a 37°C.Dopo centrifugazione a 5000 g per 10 minuti, il pellet è stato sciolto in una soluzione di 40 µl di tampone di reazione ASC e 10 µl di tampone di caricamento proteine ​​6x (TransGen, Pechino, Cina), quindi la soluzione è stata raffreddata a temperatura ambiente per 15 minuti. min., Quindi far bollire 10 minuti.I campioni proteici sono stati quindi sottoposti a Western blotting utilizzando anticorpi primari anti-ASC (Wanleibio, Shenyang, Cina) con un rapporto di diluizione di 1:500.
Seguendo una procedura precedentemente descritta [13], i surnatanti delle colture cellulari sono stati raccolti e la secrezione della citochina proinfiammatoria IL-1β è stata determinata utilizzando il kit ELISA IL-1 Beta di topo (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Convertire i valori OD450nm in concentrazioni proteiche utilizzando la curva standard IL-1β.
Le cellule rivestite sui vetrini coprioggetto sono state lavate delicatamente 3 volte in PBS caldo, fissate in un fissativo per cellule tissutali (Biosharp, Pechino, Cina) per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), in Triton X-Permeabilize allo 0,1% a 100 (diluito in PBS; Biosharp ) per 20 minuti a temperatura ambiente e bloccare in albumina di siero bovino al 5% (in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente.Le cellule sono state quindi incubate per una notte a 4°C con anticorpi primari contro ASC (diluizione 1:100) o NLRP3 (diluizione 1:100), rispettivamente, e IgG anti-coniglio di capra marcati con Cy3 (H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) o IgG anti-topo di capra coniugati con FITC (1:400; Earthox) durante la notte a 37°C al buio per 1 ora.I nuclei sono stati colorati con Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Cina) per 5 minuti e osservati al microscopio a fluorescenza (Olympus Corporation, Tokyo, Giappone).
I topi sono stati divisi in quattro gruppi (n = 7 in ciascun gruppo): (i) gruppo di controllo negativo trattato con PBS (solo PBS; sonda gastrica 100 µl/topo PBS seguita da iniezione intraperitoneale giornaliera 100 µl/topo PBS 3 ore dopo)., continuativamente per 7 giorni);(ii) gruppo di controllo negativo trattato con inibitore di MCC950 [27] (100 µl/topo tramite sonda PBS, 3 ore dopo, 10 mg/kg di peso corporeo [peso corporeo] di MCC950 [in PBS] sono stati somministrati per via intraperitoneale ogni giorno, durata 7 giorni);(iii) gruppo con infezione da cisti da G. duodenalis (1,5 x 106 cisti/topo mediante sonda gastrica, 3 ore dopo, 100 μl/topo di PBS somministrato per via intraperitoneale ogni giorno per 7 giorni);(iv) Gruppo di trattamento con inibitore MCC950 combinato con cisti da G. duodenalis (1,5 × 106 cisti/topo tramite sonda gastrica, 10 mg/kg di peso corporeo di MCC950 per via intraperitoneale al giorno per 7 giorni a 3 ore).Il peso corporeo di ciascun topo è stato monitorato quotidianamente e tutti i topi sono stati soppressi il 7° giorno.Il duodeno raccolto (3 cm di lunghezza) è stato tagliato in piccoli pezzi in 1 ml di PBS, le cisti sono state distrutte durante la notte in PBS a 4°C e i trofozoiti di G. duodenalis.Il duodeno fresco (lungo 1 cm) è stato isolato per la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E).
I topi sono stati divisi in due gruppi: (i) gruppo di controllo MOCK e (ii) gruppo inibitore MCC950.C'erano cinque trattamenti in ciascun gruppo (n = 7/gruppo di trattamento): (i) gruppo di controllo negativo del trattamento con PBS (solo PBS; 100 µl/topo PBS, iniezione intramuscolare (IM) (tibiale anteriore) [28, 29] ;( ii) gruppo di controllo negativo del plasmide pcDNA3.1(+) (100 µg/topo di DNA, tramite iniezione intramuscolare); (iii) gruppo di controllo positivo dell'infezione da cisti di G. duodenalis (1,5 x 106 cisti/topo, tramite sonda gastrica) (iv) a gruppo trattato con il plasmide pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/DNA di topo, mediante iniezione intramuscolare) e (v) un gruppo trattato con il plasmide pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/di topo DNA, dopo 12 ore di passaggio, i topi del gruppo inibitore di MCC950 hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale giornaliera di MCC950 (10 mg/kg di peso corporeo) per 7 giorni, mentre i topi del gruppo MOCK hanno ricevuto un uguale volume di trattamento con PBS. raccolti dai bulbi oculari dei topi e lasciati per una notte a 4 °C. I campioni di siero sono stati isolati utilizzando il test immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) e le misurazioni dei livelli di IL-1β.
Trentacinque topi sono stati divisi in cinque gruppi (n=7/gruppo).Il gruppo 1 era un gruppo di controllo negativo trattato con PBS: i topi hanno ricevuto 100 μl di PBS per via intramuscolare e 3 giorni dopo tramite sonda gastrica.Il gruppo 2 è un gruppo di controllo positivo infetto da cisti di G. duodenalis: ai topi sono stati iniettati 100 μl di PBS e 3 giorni dopo sono state iniettate per via intragastrica 1,5 x 106 cisti/topo.Terzo gruppo – immunizzazione plasmidica con pcDNA3.1(+) in combinazione con un gruppo di controllo per infezione di cisti duodenali: i topi hanno ricevuto 100 μg di DNA plasmidico pcDNA3.1(+)(im) per via orale, 1,5×106 cisti/topo 3 per diversi giorni.I gruppi 4 e 5 erano costituiti da plasmide giardina ricombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 o plasmide giardina pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 in combinazione con infezione da cisti di G. duodenalis.Gruppo sperimentale: i topi hanno ricevuto 100 µg di pcDNA3.DNA plasmidico 1(+)-giardina (im), quindi 3 giorni dopo, 1,5 × 106 cisti/topo sono state iniettate tramite sonda gastrica.Il peso corporeo di ciascun topo è stato monitorato dopo l'introduzione della cisti di G. duodenalis attraverso il tubo.Il duodeno fresco è stato raccolto per le misurazioni del carico parassitario e l'analisi della colorazione HE.
I cambiamenti istopatologici sono stati analizzati secondo una procedura precedentemente pubblicata [30].Il duodeno fresco è stato fissato con fissativo di cellule tissutali, incorporato in paraffina, tagliato in sezioni da 4 μm, colorato con H&E e analizzato al microscopio ottico.Cambiamenti patologici rappresentativi in ​​sette sezioni di tessuto di sette topi indipendenti sono stati valutati da un patologo ignaro del trattamento e sono stati catturati con un ingrandimento di 200x.La lunghezza dei villi e la profondità delle cripte sono state misurate secondo le modalità precedentemente descritte.
I risultati in vitro e in vivo sono stati ottenuti in triplicato.I grafici sono stati generati utilizzando GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Le differenze tra due gruppi sono state analizzate mediante t-test, mentre le differenze tra ≥ 3 gruppi sono state analizzate mediante analisi della varianza a una via (ANOVA) utilizzando il software SPSS (versione 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).I dati sono stati analizzati per l'omogeneità della varianza utilizzando il test di Levene seguito dal test post hoc di Bonferroni (B).La significatività è espressa come P<0,05, P<0,01 e P<0,001 (non significativo [ns]) (P>0,05).
La nostra precedente analisi della proteomica GEV nella Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ha mostrato che molti bersagli potrebbero essere coinvolti nell’attivazione delle vie di segnalazione infiammatoria [13].Abbiamo selezionato due bersagli promettenti, le giardine alfa-2 e alfa-7.3, amplificamo queste molecole e le usiamo per costruire il vettore di espressione eucariotica pcDNA3.1(+).Dopo il sequenziamento, i plasmidi ricombinanti di espressione giardina pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 sono stati trasfettati in macrofagi peritoneali primari di topo ed è stata identificata la proteina caspasi-1 p20 dell'infiammazione (un frammento di caspasi-1 attivata) come delucidare le molecole chiave che possono innescare l’infiammazione.I risultati hanno mostrato che le giardine alfa-2 e alfa-7.3 possono indurre un'espressione di p20 caspasi-1 simile a GEV.Non è stato riscontrato alcun effetto sull'attivazione della caspasi-1 nel controllo negativo non trattato (solo PBS) e nel controllo plasmidico pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Misurazione dell'attivazione della caspasi-1 p20 da parte dei giardini pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3.I plasmidi ricombinanti di espressione eucariotica pcDNA3.1(+)-alfa-2 e alfa-7.3 giardine (sopra ciascuna corsia) sono stati trasfettati in macrofagi peritoneali primari di topo e i surnatanti di coltura sono stati raccolti 24 ore dopo.Il Western blotting è stato utilizzato per misurare i livelli di espressione della proteina inflammasoma caspasi-1 p20.Il gruppo di trattamento solo PBS (corsia C) e il gruppo in monoterapia pcDNA3.1(+) (corsia pcDNA3.1) sono stati utilizzati come controllo negativo e il gruppo di trattamento GEV è stato utilizzato come controllo positivo.L'espressione della proteina ricombinante è stata confermata rilevando un tag istidina in ciascuna proteina e le bande proteiche attese erano alfa-2 giardina (38,2 kDa) e alfa-7,3 giardina (37,2 kDa).GEV, vescicole extracellulari di Giardia duodeno, pcDNA3.1(+), vettore linearizzato EcoRV, SUP, surnatante
Per determinare se la giardina alfa-2 e la giardina alfa-7.3 inducono l'espressione della caspasi-1 p20 e svolgono un ruolo nell'attivazione della risposta infiammatoria NLRP3 dell'ospite, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina e pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin è stato trasfettato in macrofagi peritoneali primari di topo con DNA plasmidico ricombinante e sono stati determinati i livelli di espressione, localizzazione e oligomerizzazione delle proteine ​​infiammatorie chiave NLRP3.In questo esperimento, GEV è stato utilizzato come gruppo di controllo positivo e il gruppo senza trattamento (solo PBS) o il gruppo di trattamento con trasfezione pcDNA3.1(+) era il gruppo negativo.I risultati hanno mostrato che, come nel gruppo GEV, il DNA plasmidico ricombinante di giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 e giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ha prodotto una sovraregolazione di NLRP3, pro-IL-1β e Attivazione della procaspasi-1 e della caspasi-1 (Fig. 2a).Inoltre, entrambe le giardine hanno indotto una significativa secrezione di IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7.3 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figura 2b).La maggior parte delle proteine ​​ASC erano monomeriche nel gruppo senza trattamento o nel gruppo di trattamento trasfettate con il plasmide pcDNA3.1(+), in contrasto con pcDNA3.1(+)-alpha-2 o pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardinetto.L'oligomerizzazione ASC si è verificata nel DNA plasmidico ricombinante del gruppo o gruppo di controllo positivo GEV, mostrando una forma oligomerica (Figura 2c).Questi dati preliminari suggeriscono che la giardina alfa-2 e la giardina alfa-7,3 possono indurre l'attivazione dell'infiammazione NLRP3.Successivi studi immunofluorescenti sulla localizzazione di ASC e NLRP3 hanno mostrato che nel gruppo di controllo negativo, la proteina ASC era dispersa in tutto il citoplasma e appariva come un segnale puntiforme dopo stimolazione di pcDNA3.1(+)-alfa-2 con giardina o pcDNA3.Gruppo giardina 1 (+) -alfa-7,3 o gruppo di controllo positivo GEV (Figura 2d).Nei gruppi pcDNA 3.1 trattati con controllo negativo e trattato con plasmide, il segnale della proteina NLRP3 non è stato rilevato, mentre un punto di segnale fluorescente in risposta a pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 è stato rilevato..giardine si trovano nel citoplasma o dopo stimolazione dell'HEV (Fig. 2e).Questi dati dimostrano ulteriormente che G. duodenalis giardin alfa-2 e giardin alfa-7.3 attivano l'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi peritoneali primari del topo.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin e pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin attivano l'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi peritoneali del topo.Trasfettare i plasmidi di espressione eucariotici ricombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin e pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin in macrofagi e cellule peritoneali murini primari o raccogliere il surnatante entro 24 ore per l'analisi dell'espressione e dell'oligomerizzazione , secrezione.e localizzazione delle proteine ​​infiammatorie chiave.Il gruppo solo PBS (C) e il gruppo di trattamento singolo pcDNA3.1(+) sono stati utilizzati come controllo negativo, mentre il gruppo di trattamento GEV è stato utilizzato come gruppo positivo.a Le principali proteine ​​infiammatorie NLRP3, tra cui NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspasi-1 e p20 caspasi-1, sono state rilevate mediante Western blotting.b I livelli di secrezione di IL-1β nei surnatanti sono stati determinati utilizzando il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).Le differenze tra i gruppi di controllo e sperimentali sono state analizzate mediante analisi della varianza a una via (ANOVA) utilizzando il software SPSS versione 22.0.Gli asterischi indicano differenze significative tra i gruppi **P<0,01 e ***P<0,001.c I livelli di oligomerizzazione ASC nei pellet sono stati determinati mediante analisi di reticolazione DSS, mentre i livelli ASC nei lisati cellulari sono stati utilizzati come controllo di caricamento.d Visualizzazione della localizzazione ISC mediante immunofluorescenza.e L'immunofluorescenza è stata utilizzata per visualizzare la localizzazione di NLRP3.ASC, proteina simile a un granello apoptotico;IL, interleuchina;NLRP3, recettore 3 simile all'oligomerizzazione che lega i nucleotidi;ns, non significativo (P > 0,05)
Sia G. duodenalis che i GEV che secerne attivano l'inflammasoma NLRP3 e regolano le risposte infiammatorie dell'ospite in vitro.Pertanto, il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nella patogenicità di G. duodenalis rimane poco chiaro.Per indagare su questo problema, abbiamo progettato un esperimento tra topi infettati con cisti di G. duodenalis e topi infettati con cisti di G. duodenalis + trattamento con inibitori MCC950 e abbiamo confrontato l'espressione dell'inflammasoma NLRP3 quando infetti da cisti di G. duodenalis.Uno schema dettagliato dell'esperimento è mostrato in Fig. 3a.Le variazioni del peso corporeo dei topi in diversi gruppi di trattamento sono state monitorate per 7 giorni dopo l'infezione da cisti e i risultati sono mostrati in Fig. 3b.Rispetto al gruppo trattato con PBS puro, i risultati hanno mostrato che (i) il peso corporeo dei topi infettati con cisti di G. duodenalis è diminuito dal giorno 3 al giorno 7 dopo l'infezione;(ii) il trattamento con l'inibitore MCC950 non ha avuto effetti significativi sul peso corporeo dei topi..Rispetto al gruppo con singola infezione, il peso corporeo del gruppo con infezione duodenale trattato con MCC950 è diminuito a vari livelli (Giorno 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Giorno 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001; Giorno 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; Giorno 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; (3, 24)=0,6497, P=0,0645 Giorno 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175 Giorno 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Questi dati dimostrano che l'inflammasoma NLRP3 protegge i topi da una significativa perdita di peso nelle fasi iniziali (2-4 giorni) dell'infezione duodenale.Abbiamo quindi mirato a rilevare i trofozoiti di G. duodenalis nel liquido di lavaggio duodenale e i risultati sono mostrati nella Figura 3c.Rispetto al gruppo con infezione da cisti da G. duodenalis, il numero di trofozoiti nel duodeno è aumentato significativamente dopo aver bloccato l'inflammasoma NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).I tessuti duodenali colorati con HE hanno mostrato, rispetto al controllo negativo trattato con PBS e MCC950 da soli: ​​(i) L'infezione della cisti di G. duodenalis ha provocato danni ai villi duodenali (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) e atrofia della cripta (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodeno di topi infettati con cisti di G. duodenalis e trattati con inibitori MCC950.i villi duodenali erano danneggiati e morti (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) con atrofia e ramificazione della cripta (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- F) .Questi risultati suggeriscono che l'inflammasoma NLRP3 svolge un ruolo nel ridurre la patogenicità di G. duodenalis.
Ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nell'infezione del duodeno da Giardia.I topi sono stati sottoposti a sonda gastrica (iv) con cisti duodenococciche e quindi trattati con o senza MCC950 (ip).Come controlli sono stati utilizzati singoli gruppi di trattamento con PBS o MCC950.Gruppo sperimentale e regime di trattamento.b Il peso corporeo dei topi in ciascuno dei vari gruppi di trattamento è stato monitorato per 7 giorni.La differenza tra il gruppo di infezione da G. duodenalis e il gruppo di trattamento dell'infezione da G. duodenalis + MCC950 è stata analizzata mediante t-test utilizzando il software SPSS versione 22.0.Gli asterischi indicano differenze significative a *P<0,05, **P<0,01 o ***P<0,001.c Il carico parassitario è stato determinato contando il numero di trofozoiti nel liquido di lavaggio duodenale.La differenza tra il gruppo di infezione da G. duodenalis e il gruppo di trattamento dell'infezione da G. duodenalis + MCC950 è stata analizzata mediante t-test utilizzando il software SPSS versione 22.0.Gli asterischi indicano differenze significative a *P <0,05.d Risultati della colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) dell'istopatologia duodenale.Le frecce rosse indicano danni ai villi, le frecce verdi indicano danni alle cripte.Barra della scala: 100 µm.e, f Analisi statistica dell'altezza dei villi duodenali e dell'altezza della cripta del topo.Gli asterischi indicano differenze significative con *P<0,05 e **P<0,01.I risultati sono presi da 7 esperimenti biologici indipendenti.BW, peso corporeo;ig, via di consegna intragastrica;ip, via di consegna intraperitoneale;ns, non significativo (P > 0,05);PBS, soluzione salina tamponata con fosfato;WT, tipo selvaggio
La secrezione di IL-1β è un segno distintivo dell’attivazione dell’infiammazione.Per determinare se G. duodenalis alfa-2 giardina e alfa-7.3 giardina attivano l'inflammasoma ospite NLRP3 in vivo, abbiamo usato topi WT non trattati (gruppo fittizio) e topi bloccati con inflammasoma NLRP3 (gruppo di trattamento inibito da MCC950).Uno schema dettagliato dell'esperimento è mostrato in Fig. 4a.I gruppi sperimentali erano costituiti da topi trattati con PBS, trattamento di cisti di G. duodenalis mediante sonda gastrica, iniezione intramuscolare di pcDNA3.1 e iniezione intramuscolare di pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina.Il 7° giorno dopo la somministrazione intramuscolare del plasmide ricombinante, è stato raccolto il siero ed è stato determinato il livello di IL-1β in ciascun gruppo.Come mostrato nella Figura 4b, nel gruppo MOCK: (i) rispetto al gruppo PBS, il trattamento con pcDNA3.1 non ha avuto effetti significativi sulla secrezione di IL-1β (ANOVA, F (4,29) = 4,062, P = 0,9998), tuttavia, La secrezione di IL-β era significativamente elevata nel gruppo con cisti di G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardina e pcDNA3.1- L'iniezione intramuscolare di alfa-7.3 giardina ha aumentato significativamente i livelli sierici di IL-1β (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P <0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina ha indotto alti livelli di secrezione di IL -1β nel gruppo di iniezione intramuscolare pcDNA3.1-alfa-2 giardina (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Rispetto a ciascun gruppo nel gruppo di trattamento MCC950 e nel gruppo MOCK: (i) i livelli di secrezione di IL-1β nel gruppo di controllo PBS e nel gruppo di controllo pcDNA3.1 sono diminuiti in una certa misura dopo il blocco dell’inibitore MCC950, ma la differenza non è stata significativo (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) dopo aver bloccato MCC950., la secrezione di IL-1β era significativamente ridotta nel gruppo con infezione da cisti di G. duodenalis, nel gruppo con giardina pcDNA3.1-alpha-2 e nel gruppo con giardina pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina: ANOVA, F(9, 58; ) = 3,540, P = 0,0164).Questi risultati suggeriscono che la giardina alfa-2 e la giardina alfa-7.3 mediano l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in vivo.
Le pcDNA3.1(+)-giardine attivano l'inflammasoma ospite NLRP3 in vivo.I topi sono stati immunizzati (IM) con il plasmide di espressione eucariotica ricombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina e quindi trattati con MCC950 (ip; gruppo MCC950) o meno (gruppo fittizio ).Il gruppo di trattamento con plasmide PBS o pcDNA3.1(+) è stato utilizzato come controllo negativo, il gruppo di trattamento con cisti G. duodenalis è stato utilizzato come controllo positivo.Gruppo sperimentale e regime di trattamento.b I livelli sierici di IL-1β nei topi sono stati misurati il ​​giorno 7 mediante test ELISA.Le differenze tra i gruppi nel gruppo MOCK sono state analizzate utilizzando ANOVA unidirezionale e le differenze tra il gruppo MOCK e il gruppo MCC950 sono state analizzate utilizzando il t-test del software SPSS versione 22.0.Gli asterischi indicano differenze significative tra i gruppi di trattamento nel gruppo MOCK, *P<0,05 e ***P<0,001;i segni del dollaro ($) indicano differenze significative tra ciascun gruppo nel gruppo MOCK e il gruppo MCC950 a P <0,05.Risultati di sette esperimenti biologici indipendenti.i, iniezione intramuscolare, ns, non significativo (P > 0,05)
Per studiare l'effetto dell'attivazione mediata dalla giardina alfa-2 e alfa-7.3 dell'inflammasoma ospite NLRP3 sull'infettività di G. duodenalis, abbiamo utilizzato topi WT C57BL/6 e iniettato giardina alfa-2 e giardina alfa-7.3.il plasmide è stato iniettato per via intramuscolare, dopo 3 giorni attraverso la sonda gastrica della cisti di G. duodenalis, dopodiché i topi sono stati osservati per 7 giorni.Uno schema dettagliato dell'esperimento è mostrato in Fig. 5a.Il peso corporeo di ciascun topo è stato misurato ogni giorno, campioni di tessuto duodenale fresco sono stati raccolti il ​​7° giorno dopo la somministrazione attraverso un tubo gastrico, è stato misurato il numero di trofozoiti e sono stati osservati cambiamenti istopatologici.Come mostrato nella Figura 5b, con l'aumentare del tempo di alimentazione, il peso corporeo dei topi in ciascun gruppo aumentava gradualmente.La MT dei topi ha iniziato a diminuire il 3o giorno dopo la somministrazione intragastrica di cisti di G. duodenalis, per poi aumentare gradualmente.L'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 indotta dall'iniezione intramuscolare di alfa-2 giardina e alfa7.3 giardina ha attenuato significativamente la perdita di peso nei topi (giorno 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardina, ANOVA, F (4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Giorno 1: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Giorno 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardina, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 Giorno 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 Giorno 3: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA, F(; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Giorno 3: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Giorno 4: pcDNA3.1-alfa-2 giardina, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Giorno 4: pcDNA3.1-alpha-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Giorno 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Giorno 5: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Giorno 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Giorno 6: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Giorno 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Giorno 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Il carico parassitario è stato valutato nel duodeno (Fig. 5c).Rispetto al controllo positivo non trattato e al gruppo iniettato con il vettore pcDNA3.1 vuoto, il numero di trofozoiti di G. duodenalis era significativamente ridotto nei gruppi iniettati con α-2 giardina e α-7,3 giardina (pcDNA3.1-alpha -2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Inoltre, la giardina alfa-7.3 è risultata più protettiva nei topi rispetto alla giardina alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).I risultati della colorazione HE sono mostrati in fig.5d–f.I topi iniettati con alfa-2 giardina e alfa-7.3 giardina avevano meno lesioni del tessuto duodenale, manifestate da danno ai villi, rispetto ai topi iniettati con G. duodenalis e ai topi iniettati con G. duodenalis in combinazione con un vettore pcDNA3 vuoto.1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 o P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 o P = 0,0055) e ridotta atrofia delle cripte (pcDNA3.1-alpha-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 o P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardina: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 o P = 0,0191).Questi risultati suggeriscono che la giardina alfa-2 e la giardina alfa-7,3 riducono l'infettività di G. duodenalis attivando l'inflammasoma NLRP3 in vivo.
Ruolo delle pcDNA3.1(+)-giardine nell'infezione da G. duodenalis.I topi sono stati immunizzati (IM) con plasmidi di espressione eucariotica ricombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardina o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardina e quindi sfidati con cisti di G. duodenalis (ig).Il gruppo PBS e il gruppo di trattamento della cisti duodenale pcDNA3.1(+) + sono stati utilizzati come gruppi di controllo negativo, mentre il gruppo di trattamento della cisti duodenale è stato utilizzato come gruppo di controllo positivo.Gruppo sperimentale e regime di trattamento.b La MT dei topi in ciascuno dei vari gruppi di trattamento è stata monitorata per 7 giorni dopo la sfida.Gli asterischi indicano differenze significative tra i gruppi del gruppo G. duodenalis e del gruppo pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine, *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001;il segno del dollaro ($) indica una differenza significativa tra ciascun gruppo di G. duodenalis e il gruppo jardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3, $$P<0,01 e $$$P<0,001.c Il carico parassitario è stato determinato contando il numero di trofozoiti in 1 ml di lavaggio duodenale dal duodeno (lungo 3 cm) ed espresso come numero di parassiti per cm di duodeno.Le differenze tra il gruppo di infezione da G. duodenalis, il gruppo di giardine pcDNA3.1(+)-alpha-2 e il gruppo di giardine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 sono stati analizzati mediante ANOVA unidirezionale utilizzando il software SPSS versione 22.0.Gli asterischi indicano differenze significative con **P<0,01 e ***P<0,001.d Cambiamenti istopatologici nel duodeno.Le frecce rosse indicano danni ai villi, le frecce verdi indicano danni alle cripte.Barra della scala: 100 µm.e, f Analisi statistica dell'altezza dei villi duodenali del topo (e) e dell'altezza della cripta (f).Le differenze tra i gruppi nella Figura 1d sono state analizzate mediante ANOVA unidirezionale utilizzando il software SPSS versione 22.0.Gli asterischi indicano differenze significative con *P<0,05 e **P<0,01.Risultati di sette esperimenti biologici indipendenti.ns, non significativo (P > 0,05)
Giardia duodeno è un noto parassita intestinale dell'uomo e di altri mammiferi che causa la giardiasi.Nel 2004, è stata inclusa nell’Iniziativa sulle malattie trascurate dell’OMS a causa della sua elevata prevalenza nell’arco di 6 anni, soprattutto nelle comunità di basso status socioeconomico [32].Il sistema immunitario innato svolge un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria all'infezione da G. duodenalis.È stato segnalato che i macrofagi dei topi fagocitano e uccidono G. duodenalis rilasciando trappole extracellulari [33].I nostri studi precedenti hanno dimostrato che G. duodenalis, un parassita extracellulare non invasivo, attiva le vie di segnalazione infiammatoria p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 e NLRP3 nei macrofagi di topo per regolare le risposte infiammatorie dell'ospite e il GEV rilasciato può migliorare questo processo.13], 24].Tuttavia, gli esatti PAMP coinvolti nell'infiammazione regolata dall'inflammasoma NLRP3 nel GEV e il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 nella giardiasi rimangono da chiarire.Per far luce su queste due domande, abbiamo condotto questo studio.
L'inflammasoma NLRP3 si trova nel citoplasma delle cellule immunitarie e può essere attivato da varie particelle come cristalli di acido urico, tossine, batteri, virus e parassiti.Negli studi sui batteri, le tossine sono state identificate come PAMP chiave che attivano i sensori infiammatori, portando all’infiammazione e alla morte cellulare [34].Alcune tossine strutturalmente diverse, come l'emolisina dello Staphylococcus aureus [35] e dell'Escherichia coli [36], l'emolisina BL (HBL) dell'enterotossina (NHE) [37], inducono l'attivazione dell'infiammazione NLRP3.Studi virali hanno dimostrato che le proteine ​​di virulenza come la proteina dell’involucro (E) del SARS-COV-2 [38] e la proteina NS5 del virus Zika [39] sono importanti PAMP riconosciuti dal recettore NLRP3.Negli studi sui parassiti, è stato segnalato che molti parassiti sono associati all'attivazione dell'inflammasoma dell'ospite, come Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] e Leishmania [42].Le proteine ​​granulari dense GRA35, GRA42 e GRA43, associate alla virulenza del Toxoplasma gondii, sono necessarie per l'induzione della piroptosi nei macrofagi del ratto Lewis [43].Inoltre, alcuni studi sulla Leishmania si sono concentrati su singole molecole coinvolte nell’inflammasoma NLRP3, come il lipofosfoglicano della membrana parassita [44] o la metalloproteasi di zinco [45].Tra i geni della famiglia di geni alfa-giardin simili all'annessina, alfa-1 giardin ha dimostrato di essere un potenziale candidato vaccino che fornisce protezione contro G. duodenalis in un modello murino [18].Nel nostro studio, abbiamo selezionato i fattori di virulenza di G. duodenalis alfa-2 e alfa-7,3 giardine, che sono esclusivi della giardia ma relativamente meno segnalati.Questi due geni bersaglio sono stati clonati nel vettore del sistema di espressione eucariotica pcDNA3.1(+) per l'analisi dell'attivazione dell'infiammazione.
Nel nostro modello murino, i frammenti di caspasi scissi servono come marcatori di attivazione infiammatoria.Dopo la stimolazione, NLRP3 interagisce con ASC, recluta procaspasi e genera caspasi attive che scindono pro-IL-1β e pro-IL-18 in IL-1β e IL-18 maturi, rispettivamente -18.Le caspasi infiammatorie (caspasi-1, -4, -5 e -11) sono una famiglia conservata di proteasi della cisteina che sono fondamentali per la difesa innata e sono coinvolte nell'infiammazione e nella morte cellulare programmata [46].La caspasi-1 viene attivata dagli inflammasomi canonici [47], mentre le caspasi-4, -5 e -11 vengono scisse durante la formazione di inflammasomi atipici [48].In questo studio, abbiamo utilizzato i macrofagi peritoneali del topo come modello e studiato la caspasi-1 scissa da p20 caspasi-1 come marcatore dell'attivazione dell'infiammazione NLRP3 dell'ospite negli studi sull'infezione da G. duodenalis.I risultati hanno mostrato che molte alfa-giardine sono responsabili della tipica attivazione dell’infiammazione, il che è coerente con la scoperta di molecole chiave di virulenza coinvolte in batteri e virus.Tuttavia, il nostro studio è solo uno screening preliminare e ci sono altre molecole che possono attivare gli inflammasomi non classici, poiché il nostro studio precedente ha trovato inflammasomi sia classici che non classici nell’infezione da G. duodenalis [13].Per determinare ulteriormente se la caspasi-1 p20 generata è associata all'inflammasoma NLRP3, abbiamo trasfettato le giardine alfa-2 e alfa-7.3 in macrofagi peritoneali di topo per determinare i livelli di espressione proteica delle molecole chiave e i livelli di oligomerizzazione ASC, confermando che entrambe le α-giardine si attivano inflammasoma NLRP3.I nostri risultati sono leggermente diversi da quelli di Manko-Prykhoda et al., che hanno riferito che la stimolazione delle cellule Caco-2 con ceppi EPEC di G. muris o E. coli da sola può aumentare l'intensità della fluorescenza di NLRP3, ASC e caspasi-1, sebbene non in modo significativo, mentre la costimolazione di G. muris ed E. coli ha aumentato i livelli di tre proteine ​​[49].Questa discrepanza può essere dovuta a differenze nella selezione delle specie Giardia, delle linee cellulari e delle cellule primarie.Abbiamo anche eseguito test in vivo utilizzando MCC950 in topi femmine WT C57BL/6 di 5 settimane, che sono più suscettibili a G. duodenalis.MCC950 è un potente e selettivo inibitore NLRP3 di piccole molecole che blocca l'attivazione canonica e non canonica di NLRP3 a concentrazioni nanomolari.MCC950 inibisce l'attivazione di NLRP3 ma non influenza l'attivazione delle vie infiammatorie AIM2, NLRC4 e NLRP1 o delle vie di segnalazione TLR [27].MCC950 blocca l'attivazione di NLRP3 ma non inibisce l'avvio di NLRP3, l'efflusso di K+, l'afflusso di Ca2+ o l'interazione tra NLRP3 e ASC;invece, inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 bloccando l'oligomerizzazione ASC [27].Pertanto, abbiamo utilizzato MCC950 in uno studio in vivo per determinare il ruolo dell'inflammasoma NLRP3 dopo l'iniezione di giardina.La caspasi-1 p10 attivata scinde le citochine proinfiammatorie pro-IL-1β e pro-IL-18 in IL-1β e IL-18 maturi [50].In questo studio, i livelli sierici di IL-1β nei topi trattati con giardina con o senza MCC950 sono stati utilizzati come indicatore dell'attivazione dell'inflammasoma NLRP3.Come previsto, il trattamento con MCC950 ha ridotto significativamente i livelli sierici di IL-1β.Questi dati dimostrano chiaramente che G. duodenalis giardin alfa-2 e giardin alfa-7.3 sono in grado di attivare l'inflammasoma murino NLRP3.
Dati significativi accumulati negli ultimi dieci anni hanno dimostrato che IL-17A è il principale regolatore dell’immunità contro G. muris, inducendo la segnalazione di IL-17RA, producendo peptidi antimicrobici e regolando l’attivazione del complemento [51].Tuttavia, l’infezione da Giardia si verifica più frequentemente nei giovani adulti ed è stato riportato che l’infezione da Giardia nei topi giovani non attiva la risposta dell’IL-17A per esercitare il suo effetto protettivo [52], spingendo i ricercatori a cercare altri Giardia immunomodulatori.meccanismi di infezione da elminti.Gli autori di un recente studio hanno riferito che G. muris può attivare l'inflammasoma NLRP3 da parte di E. coli EPEC, che promuove la produzione di peptidi antimicrobici e riduce la sua capacità di attaccamento e il numero di trofozoiti nel tratto intestinale, riducendo così la gravità del colon malattie causate dai bacilli [49 ].L'inflammasoma NLRP3 è coinvolto nello sviluppo di varie malattie.Gli studi hanno dimostrato che Pseudomonas aeruginosa innesca l'autofagia nei macrofagi per evitare la morte cellulare e questo processo dipende dall'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 [53].Per N. caninum, l'attivazione mediata da specie reattive dell'ossigeno dell'inflammasoma NLRP3 ne limita la replicazione nell'ospite, rendendolo un potenziale bersaglio terapeutico [9].È stato scoperto che il paracoccidioides brasiliensis induce l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3 nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo del topo, con conseguente rilascio della citochina infiammatoria IL-1β, che svolge un ruolo fondamentale nella difesa dell’ospite [10].Diverse specie di Leishmania, tra cui L. amazonensis, L. major, L. braziliensis e L. infantum chagasi, attivano NLRP3 e la caspasi-1 ASC-dipendente nei macrofagi, così come l'infezione da Leishmania.La replicazione del parassita è migliorata nei topi carenti del gene NLRP3/ASC/caspasi-1 [11].Zamboni et al.È stato segnalato che l'infezione da Leishmania induce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi, che limita la replicazione intracellulare del parassita.Pertanto, la Leishmania può inibire l'attivazione di NLRP3 come strategia di evitamento.Negli studi in vivo, l’inflammasoma NLRP3 ha contribuito all’eliminazione della Leishmania, ma non ha influenzato i tessuti [54].Al contrario, negli studi sull’elmintiasi, l’attivazione dell’inflammasoma NLRP3 ha soppresso l’immunità protettiva dell’ospite contro l’elmintiasi gastrointestinale [12].La Shigella è uno dei principali batteri che causano la diarrea in tutto il mondo.Questi batteri possono indurre la produzione di IL-1β attraverso l’efflusso di K+ mediato dal recettore P2X7, specie reattive dell’ossigeno, acidificazione lisosomiale e danno mitocondriale.L'inflammasoma NLRP3 regola negativamente la fagocitosi e l'attività battericida dei macrofagi contro Shigella [55].Studi sul Plasmodium hanno dimostrato che topi carenti di AIM2, NLRP3 o caspasi-1 infettati da Plasmodium producono alti livelli di interferone di tipo 1 e sono più resistenti all’infezione da Plasmodium [56].Tuttavia, il ruolo della giardina alfa-2 e della giardina alfa-7.3 nell'indurre l'attivazione patogena dell'infiammazione NLRP3 nei topi non è chiaro.
In questo studio, l'inibizione dell'inflammasoma NLRP3 da parte di MCC950 ha ridotto il peso corporeo e aumentato il numero di trofozoiti nel liquido di lavaggio intestinale nei topi, determinando cambiamenti patologici più gravi nel tessuto duodenale.La giardina alfa-2 e la giardina alfa-7.3 attivano l'inflammasoma NLRP3 del topo ospite, aumentano il peso corporeo del topo, riducono il numero di trofozoiti nel liquido di lavaggio intestinale e alleviano le lesioni duodenali patologiche.Questi risultati suggeriscono che G. duodenalis può attivare l'inflammasoma ospite NLRP3 tramite alfa-2 giardina e alfa-7,3 giardina, riducendo la patogenicità di G. duodenalis nei topi.
Collettivamente, i nostri risultati dimostrano che le giardine alfa-2 e alfa-7.3 inducono l'attivazione dell'inflammasoma ospite NLRP3 e riducono l'infettività di G. duodenalis nei topi.Pertanto, queste molecole sono bersagli promettenti per la prevenzione della giardiasi.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
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