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Toxoplasma gondii è un parassita protozoico intracellulare che modula il microambiente dell'ospite infetto ed è noto per essere associato all'incidenza della crescita del tumore cerebrale.In questo studio, ipotizziamo che il miRNA-21 esosomiale dell'infezione da Toxoplasma promuova la crescita del tumore cerebrale.Gli esosomi della microglia BV2 infetta da Toxoplasma sono stati caratterizzati ed è stata confermata l'interiorizzazione delle cellule di glioma U87.I profili di espressione di microRNA esosomiali sono stati analizzati utilizzando array di microRNA e microRNA-21A-5p associati a Toxoplasma gondii e smistamento del tumore.Abbiamo anche studiato i livelli di mRNA dei geni associati al tumore nelle cellule di glioma U87 alterando i livelli di miR-21 negli esosomi e l'effetto degli esosomi sulla proliferazione delle cellule di glioma U87 umano.Negli esosomi delle cellule di glioma U87 infettate con Toxoplasma gondii, l'espressione del microRNA-21 è aumentata e l'attività dei geni antitumorali (FoxO1, PTEN e PDCD4) è ridotta.Gli esosomi derivati ​​da BV2 infettati da Toxoplasma inducono la proliferazione delle cellule di glioma U87.Gli esosomi inducono la crescita delle cellule U87 in un modello di tumore murino.Suggeriamo che l'aumento del miR-21 esosomico nella microglia BV2 infetta da Toxoplasma possa svolgere un ruolo importante come promotore della crescita cellulare nelle cellule di glioma U87 regolando i geni antitumorali.
Si stima che nel 2018 siano stati diagnosticati in tutto il mondo oltre 18,1 milioni di casi di cancro avanzato, con circa 297.000 tumori del sistema nervoso centrale diagnosticati ogni anno (1,6% di tutti i tumori)1.Precedenti ricerche hanno dimostrato che i fattori di rischio per lo sviluppo di tumori cerebrali umani includono vari prodotti chimici, storia familiare e radiazioni ionizzanti provenienti da apparecchiature terapeutiche e diagnostiche.Tuttavia, la causa esatta di queste neoplasie è sconosciuta.Circa il 20% di tutti i tumori nel mondo sono causati da agenti infettivi, inclusi virus, batteri e parassiti3,4.Gli agenti patogeni infettivi interrompono i meccanismi genetici della cellula ospite, come la riparazione del DNA e il ciclo cellulare, e possono portare a infiammazione cronica e danni al sistema immunitario5.
Gli agenti infettivi associati al cancro umano sono i patogeni virali più comuni, compresi i virus del papilloma umano e i virus dell'epatite B e C.I parassiti possono anche svolgere un ruolo potenziale nello sviluppo del cancro umano.Diverse specie di parassiti, in particolare Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis e Hymenolepis nana, sono state implicate in vari tipi di cancro umano 6,7,8.
Toxoplasma gondii è un protozoo intracellulare che regola il microambiente delle cellule ospiti infette.Si stima che questo parassita infetti circa il 30% della popolazione mondiale, mettendo a rischio l'intera popolazione9,10.Il Toxoplasma gondii può infettare organi vitali, incluso il sistema nervoso centrale (SNC), e causare malattie gravi come meningite ed encefalite mortali, specialmente nei pazienti immunocompromessi9.Tuttavia, Toxoplasma gondii può anche alterare l'ambiente dell'ospite infetto modulando la crescita cellulare e le risposte immunitarie in individui immunocompetenti, portando al mantenimento di un'infezione cronica asintomatica9,11.È interessante notare che, data la correlazione tra la prevalenza di T. gondii e l'incidenza del tumore al cervello, alcuni rapporti suggeriscono che i cambiamenti ambientali dell'ospite in vivo dovuti all'infezione cronica da T. gondii assomigliano al microambiente tumorale.
Gli esosomi sono noti come comunicatori intercellulari che forniscono contenuto biologico, comprese proteine ​​e acidi nucleici, dalle cellule vicine16,17.Gli esosomi possono influenzare i processi biologici correlati al tumore come l'anti-apoptosi, l'angiogenesi e le metastasi nel microambiente tumorale.In particolare, i miRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti lunghi circa 22 nucleotidi, sono importanti regolatori genici post-trascrizionali che controllano oltre il 30% dell'mRNA umano attraverso il complesso di silenziamento indotto dai miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii può interrompere i processi biologici controllando l'espressione di miRNA negli ospiti infetti.I miRNA dell'ospite contengono segnali importanti per la regolazione dei processi biologici dell'ospite per raggiungere la strategia di sopravvivenza del parassita.Pertanto, lo studio dei cambiamenti nel profilo del miRNA dell'ospite dopo l'infezione da T. gondii può aiutarci a comprendere più chiaramente l'interazione tra l'ospite e T. gondii.In effetti, Thirugnanam et al.15 hanno suggerito che T. gondii promuova la carcinogenesi cerebrale alterando la sua espressione su specifici miRNA dell'ospite associati alla crescita del tumore e hanno scoperto che T. gondii può causare gliomi negli animali da esperimento.
Questo studio si concentra sull'alterazione del miR-21 esosomiale nella microglia ospite infettata da Toxoplasma BV2.Abbiamo osservato un possibile ruolo del miR-21 esosomiale alterato nella crescita delle cellule di glioma U87 a causa della ritenzione nel nucleo di FoxO1/p27, che è il bersaglio del miR-21 sovraespresso.
Gli esosomi derivati ​​da BV2 sono stati ottenuti mediante centrifugazione differenziale e convalidati con vari metodi per prevenire la contaminazione con componenti cellulari o altre vescicole.L'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) ha mostrato modelli distinti tra le proteine ​​estratte dalle cellule BV2 e dagli esosomi (Figura 1A) e i campioni sono stati valutati per la presenza di Alix, che è stata analizzata mediante Western blotting di marcatori proteici exosomiali in .L'etichettatura Alix è stata trovata nelle proteine ​​esosomiche ma non nelle proteine ​​​​del lisato cellulare BV2 (Fig. 1B).Inoltre, l'RNA purificato da esosomi derivati ​​da BV2 è stato analizzato utilizzando un bioanalizzatore.Le subunità ribosomiali 18S e 28S sono state osservate raramente nel modello di migrazione dell'RNA esosomiale, indicando una purezza affidabile (Figura 1C).Infine, la microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che gli esosomi osservati avevano una dimensione di circa 60-150 nm e avevano una struttura simile a una coppa tipica della morfologia dell'esosoma (Fig. 1D).
Caratterizzazione di esosomi derivati ​​da cellule BV2.(A) Pagina della scheda di sicurezza.Le proteine ​​sono state isolate da cellule BV2 o esosomi derivati ​​da BV2.I modelli proteici differiscono tra cellule ed esosomi.(B) Analisi Western blot di un marcatore esosomiale (Alix).(C) Valutazione dell'RNA purificato da cellule BV2 ed esosomi derivati ​​da BV2 utilizzando un bioanalizzatore.Pertanto, le subunità ribosomiali 18S e 28S nelle cellule BV2 sono state trovate raramente nell'RNA esosomiale.(D) La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che gli esosomi isolati dalle cellule BV2 erano macchiati negativamente con acetato di uranile al 2%.Gli esosomi hanno una dimensione di circa 60-150 nm e sono a forma di coppa (Song e Jung, dati non pubblicati).
L'internalizzazione cellulare degli esosomi derivati ​​da BV2 nelle cellule di glioma umano U87 è stata osservata mediante microscopia confocale.Gli esosomi marcati con PKH26 sono localizzati nel citoplasma delle cellule U87.I nuclei sono stati colorati con DAPI (Fig. 2A), indicando che gli esosomi derivati ​​da BV2 possono essere interiorizzati dalle cellule ospiti e influenzare l'ambiente delle cellule riceventi.
L'interiorizzazione di esosomi derivati ​​da BV2 in cellule di glioma U87 e di esosomi derivati ​​da BV2 infettati da Toxoplasma RH ha indotto la proliferazione di cellule di glioma U87.(A) Exosomes inghiottito dalle cellule U87 misurate mediante microscopia confocale.Le cellule di glioma U87 sono state incubate con esosomi marcati con PKH26 (rosso) o senza controllo per 24 ore.I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu) e quindi osservati al microscopio confocale (barra della scala: 10 μm, x 3000).(B) la proliferazione delle cellule di glioma U87 è stata determinata mediante analisi di proliferazione cellulare.Le cellule di glioma U87 sono state trattate con esosomi per il tempo indicato. *P <0,05 è stato ottenuto dal test t di Student. *P <0,05 è stato ottenuto dal test t di Student. *P < 0,05 получено по t-criteriю Стьюдента. * P <0, 05 dal test t di Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-criteria Стьюдента. * P <0,05 ottenuto utilizzando il test t di Student.
Dopo aver confermato l'interiorizzazione degli esosomi derivati ​​​​da BV2 nelle cellule di glioma U87, abbiamo eseguito test di proliferazione cellulare per studiare il ruolo degli esosomi derivati ​​​​da BV2 derivati ​​​​da Toxoplasma nello sviluppo di cellule di glioma umano.Il trattamento delle cellule U87 con esosomi da cellule BV2 infette da T. gondii ha mostrato che gli esosomi derivati ​​da BV2 infettati da T. gondii hanno causato una proliferazione significativamente più elevata delle cellule U87 rispetto al controllo (Fig. 2B).
Inoltre, la crescita delle cellule U118 ha avuto gli stessi risultati dell'U87, poiché gli esosomi stimolati dal toxoplasma hanno causato i più alti livelli di proliferazione (dati non mostrati).Sulla base di questi dati, possiamo indicare che gli esosomi infetti da Toxoplasma derivati ​​​​da BV2 svolgono un ruolo importante nella proliferazione delle cellule di glioma.
Per studiare l'effetto degli esosomi derivati ​​​​da BV2 infetti da Toxoplasma sullo sviluppo del tumore, abbiamo iniettato cellule di glioma U87 in topi nudi per un modello di xenotrapianto e abbiamo iniettato esosomi derivati ​​da BV2 o esosomi derivati ​​da BV2 infetti da RH.Dopo che i tumori sono diventati evidenti dopo 1 settimana, ciascun gruppo sperimentale di 5 topi è stato diviso in base alla dimensione del tumore per determinare lo stesso punto di partenza e la dimensione del tumore è stata misurata per 22 giorni.
Nei topi con il modello di xenotrapianto U87, al giorno 22 sono stati osservati dimensioni e peso del tumore significativamente maggiori nel gruppo exosoma infetto da RH derivato da BV2 (Fig. 3A, B).D'altra parte, non vi era alcuna differenza significativa nella dimensione del tumore tra il gruppo exosome derivato da BV2 e il gruppo di controllo dopo il trattamento exosome.Inoltre, i topi iniettati con cellule di glioma ed esosomi hanno mostrato visivamente il volume tumorale più grande nel gruppo di esosomi derivati ​​​​da BV2 infetti da RH (Fig. 3C).Questi risultati dimostrano che gli esosomi infetti da Toxoplasma derivati ​​da BV2 inducono la crescita del glioma in un modello di tumore murino.
Oncogenesi (AC) di esosomi derivati ​​da BV2 in un modello di topo xenotrapianto U87.La dimensione del tumore (A) e il peso (B) erano significativamente aumentati nei topi nudi BALB/c trattati con esosomi infetti da RH derivati ​​da BV2.Topi nudi BALB/c (C) sono stati iniettati per via sottocutanea con 1 x 107 cellule U87 sospese in una miscela di Matrigel.Sei giorni dopo l'iniezione, nei topi sono stati trattati 100 μg di esosomi derivati ​​da BV2.Le dimensioni e il peso del tumore sono stati misurati rispettivamente nei giorni indicati e dopo il sacrificio. * P <0,05. * P <0,05. *P < 0,05. * P <0,05. * P <0,05。 * P <0,05。 *P < 0,05. * P <0,05.
I dati hanno mostrato che 37 miRNA (16 sovraespressi e 21 downespressi) associati all'immunità o allo sviluppo del tumore erano significativamente alterati nella microglia dopo l'infezione con il ceppo Toxoplasma RH (Fig. 4A).I livelli di espressione relativa di miR-21 tra miRNA alterati sono stati confermati mediante RT-PCR in tempo reale in esosomi derivati ​​da BV2, esosomi trattati con cellule BV2 e U87.L'espressione di miR-21 ha mostrato un aumento significativo degli esosomi da cellule BV2 infettate da Toxoplasma gondii (ceppo RH) (Fig. 4B).I livelli di espressione relativa di miR-21 nelle cellule BV2 e U87 sono aumentati dopo l'assorbimento di esosomi alterati (Fig. 4B).I livelli relativi di espressione di miR-21 nei tessuti cerebrali di pazienti con tumore e topi infettati da Toxoplasma gondii (ceppo ME49) erano rispettivamente superiori rispetto ai controlli (Fig. 4C).Questi risultati sono correlati alle differenze tra i livelli di espressione dei microRNA previsti e confermati in vitro e in vivo.
Cambiamenti nell'espressione di miP-21a-5p esosomiale nella microglia infettata da Toxoplasma gondii (RH).(A) Dimostra cambiamenti significativi nel siRNA associati all'immunità o allo sviluppo del tumore in seguito all'infezione da T. gondii RH.(B) I livelli di espressione relativi di miR-21 sono stati rilevati mediante RT-PCR in tempo reale in esosomi derivati ​​da BV2, esosomi trattati con BV2 e cellule U87.(C) Livelli di espressione relativi di miR-21 sono stati trovati nei tessuti cerebrali di pazienti con tumore (N=3) e topi infettati da Toxoplasma gondii (ceppo ME49) (N=3). *P <0,05 è stato ottenuto dal test t di Student. *P <0,05 è stato ottenuto dal test t di Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-criteria Стьюдента. * P <0,05 è stato ottenuto utilizzando il test t di Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-criteria Стьюдента. * P <0,05 ottenuto utilizzando il test t di Student.
Gli esosomi delle cellule BV2 infette da RH hanno portato alla crescita di gliomi in vivo e in vitro (Fig. 2, 3).Per rilevare mRNA rilevanti, abbiamo esaminato i livelli di mRNA di geni bersaglio antitumorali, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN e morte cellulare programmata 4 (PDCD4) in cellule U87 infettate con esosomi derivati ​​da BV2 o RH BV2.L'analisi bioinformatica ha dimostrato che diversi geni associati al tumore, inclusi i geni FoxO1, PTEN e PDCD4, hanno siti di legame miR-2121,22.I livelli di mRNA dei geni bersaglio antitumorali erano ridotti negli esosomi derivati ​​da BV2 infetti da RH rispetto agli esosomi derivati ​​da BV2 (Fig. 5A).FoxO1 ha mostrato livelli proteici ridotti negli esosomi derivati ​​da BV2 infetti da RH rispetto agli esosomi derivati ​​da BV2 (Figura 5B).Sulla base di questi risultati, potremmo confermare che gli esosomi derivati ​​da BV2 infetti da RH regolano i geni anti-oncogenici, mantenendo il loro ruolo nella crescita del tumore.
Gli esosomi derivati ​​da BV2 infetti da Toxoplasma RH inducono la soppressione dei geni antitumorali nelle cellule di glioma U87 da parte di esosomi derivati ​​da BV2 infetti da Toxoplasma RH.( A ) PCR in tempo reale dell'espressione di FoxO1, PTEN e PDCD4 negli esosomi derivati ​​​​da BV2 infetto da T. gondii RH rispetto agli esosomi PBS.L'mRNA di β-actina è stato utilizzato come controllo.(B) L'espressione di FoxO1 è stata determinata mediante Western blotting e i dati densitometrici sono stati valutati statisticamente utilizzando il programma ImageJ. *P <0,05 è stato ottenuto dal test t di Student. *P <0,05 è stato ottenuto dal test t di Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-criteria Стьюдента. * P <0,05 è stato ottenuto utilizzando il test t di Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-criteria Стьюдента. * P <0,05 ottenuto utilizzando il test t di Student.
Per comprendere l'effetto del miP-21 negli esosomi sulla regolazione genica associata al tumore, le cellule U87 sono state trasfettate con un inibitore del miP-21 utilizzando Lipofectamine 2000 e le cellule sono state raccolte 24 ore dopo la trasfezione.I livelli di espressione di FoxO1 e p27 nelle cellule trasfettate con inibitori di miR-21 sono stati confrontati con cellule trattate con esosomi derivati ​​da BV2 usando qRT-PCR (Fig. 6A, B).La trasfezione dell'inibitore miR-21 nelle cellule U87 ha ridotto significativamente l'espressione di FoxO1 e p27 (FIG. 6).
MiP-21 derivato da BV2 esosomiale infettato da RH ha alterato l'espressione di FoxO1/p27 nelle cellule di glioma U87.Le cellule U87 sono state trasfettate con l'inibitore miP-21 usando Lipofectamine 2000 e le cellule sono state raccolte 24 ore dopo la trasfezione.I livelli di espressione di FoxO1 e p27 nelle cellule trasfettate con inibitori di miR-21 sono stati confrontati con i livelli nelle cellule trattate con esosomi derivati ​​da BV2 utilizzando qRT-PCR (A, B).
Per sfuggire alla risposta immunitaria dell'ospite, il parassita Toxoplasma si trasforma in una cisti tissutale.Parassitano vari tessuti, tra cui il cervello, il cuore e il muscolo scheletrico, per tutta la vita dell'ospite e ne modulano la risposta immunitaria.Inoltre, possono regolare il ciclo cellulare e l'apoptosi delle cellule ospiti, promuovendone la proliferazione14,24.Il toxoplasma gondii infetta prevalentemente le cellule dendritiche dell'ospite, i neutrofili e la linea di monociti/macrofagi, inclusa la microglia cerebrale.Toxoplasma gondii induce la differenziazione dei macrofagi del fenotipo M2, influenza la guarigione delle ferite dopo l'infezione da agenti patogeni ed è anche associato a ipervascolarizzazione e fibrosi granulomatosa.Questa patogenesi comportamentale dell'infezione da Toxoplasma può essere correlata a marcatori associati allo sviluppo del tumore.L'ambiente ostile regolato dal Toxoplasma può assomigliare al corrispondente precancro.Pertanto, si può presumere che l'infezione da Toxoplasma dovrebbe contribuire allo sviluppo di tumori cerebrali.Infatti, sono stati riportati alti tassi di infezione da Toxoplasma nel siero di pazienti con vari tumori cerebrali.Inoltre, Toxoplasma gondii può essere un altro effettore cancerogeno e agire in sinergia per aiutare altri cancerogeni infettivi a sviluppare tumori cerebrali.A questo proposito, vale la pena notare che P. falciparum e il virus Epstein-Barr contribuiscono sinergicamente alla formazione del linfoma di Burkitt.
Il ruolo degli esosomi come regolatori nel campo della ricerca sul cancro è stato ampiamente studiato.Tuttavia, il ruolo degli esosomi tra parassiti e ospiti infetti rimane poco compreso.Finora, vari regolatori, comprese le proteine ​​secrete, hanno spiegato i processi biologici mediante i quali i parassiti protozoici resistono all'attacco dell'ospite e perpetuano l'infezione.Recentemente, c'è stato un crescente concetto che le microvescicole associate ai protozoi e i loro microRNA interagiscono con le cellule ospiti per creare un ambiente favorevole alla loro sopravvivenza.Pertanto, sono necessari ulteriori studi per scoprire la relazione tra miRNA esosomiali alterati e proliferazione delle cellule di glioma.L'alterazione del microRNA (geni del cluster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 e miR-17-92) si lega al promotore STAT3 nei macrofagi umani infetti da toxoplasma, è regolata e induce anti -apoptosi in risposta all'infezione da Toxoplasma gondii 29 .L'infezione da toxoplasma aumenta l'espressione di miR-17-5p e miR-106b-5p, che sono associati a diverse malattie iperproliferative 30 .Questi dati suggeriscono che i miRNA dell'ospite regolati dall'infezione da Toxoplasma sono molecole importanti per la sopravvivenza e la patogenesi del parassita nel comportamento biologico dell'ospite.
I miRNA alterati possono influenzare vari tipi di comportamento durante l'inizio e la progressione delle cellule maligne, compresi i gliomi: autosufficienza dei segnali di crescita, insensibilità ai segnali di inibizione della crescita, evasione dell'apoptosi, potenziale replicativo illimitato, angiogenesi, invasione e metastasi e infiammazione.Nel glioma, i miRNA alterati sono stati identificati in diversi studi di profilo di espressione.
Nel presente studio, abbiamo confermato alti livelli di espressione di miRNA-21 nelle cellule ospiti infette da toxoplasma.miR-21 è stato identificato come uno dei microRNA più frequentemente sovraespressi nei tumori solidi, compresi i gliomi, 33 e la sua espressione è correlata al grado del glioma.Sempre più prove suggeriscono che il miR-21 è un nuovo oncogene che agisce come fattore anti-apoptotico nella crescita del glioma ed è altamente sovraespresso nei tessuti e nel plasma delle neoplasie del cervello umano.È interessante notare che l'inattivazione del miR-21 nelle cellule e nei tessuti del glioma innesca l'inibizione della proliferazione cellulare a causa dell'apoptosi dipendente dalla caspasi.L'analisi bioinformatica degli obiettivi previsti da miR-21 ha rivelato più geni oncosoppressori associati a percorsi di apoptosi, tra cui morte cellulare programmata 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN e forkhead box O1 (FoxO1), con il sito di legame miR-2121..22.38.
FoxO1, come uno dei fattori di trascrizione (FoxO), è coinvolto nello sviluppo di vari tipi di cancro umano e può regolare l'espressione di geni oncosoppressori come p21, p27, Bim e FasL40.FoxO1 può legare e attivare inibitori del ciclo cellulare come p27 per sopprimere la crescita cellulare.Inoltre, FoxO1 è un effettore chiave della segnalazione PI3K/Akt e regola molti processi biologici come la progressione del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare attraverso l'attivazione della trascrizione di p2742.
In conclusione, riteniamo che il miR-21 esosomico derivato dalla microglia infetta da Toxoplasma possa svolgere un ruolo importante come regolatore della crescita delle cellule di glioma (Fig. 7).Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per trovare un collegamento diretto tra miR-21 esosomiale, infezione da Toxoplasma alterata e crescita del glioma.Questi risultati dovrebbero fornire un punto di partenza per studiare la relazione tra l'infezione da Toxoplasma e l'incidenza del glioma.
In questo studio viene proposto un diagramma schematico del meccanismo di carcinogenesi del glioma (cervello).L'autore disegna in PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Tutti i protocolli sperimentali in questo studio, compreso l'uso di animali, erano conformi alle Linee guida etiche standard del comitato per la cura degli animali e gli utenti dell'Università nazionale di Seoul e sono stati approvati dall'Institutional Review Board della Seoul National University School of Medicine (numero IRB SNU- 150715).-2).Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le raccomandazioni ARRIVE.
La microglia di topo BV2 e le cellule di glioma umano U87 sono state coltivate rispettivamente nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM; Welgene, Seoul, Corea) e nel mezzo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), ciascuno contenente il 10% di siero bovino fetale, 4 mM l- glutammina, penicillina 0,2 mM e streptomicina 0,05 mM.Le cellule sono state coltivate in un incubatore con il 5% di CO2 a 37°C.Un'altra linea cellulare di glioma, U118, è stata utilizzata per il confronto con le cellule U87.
Per isolare gli esosomi dai ceppi RH e ME49 infetti da T. gondii, i tachizoiti di T. gondii (ceppo RH) sono stati raccolti dalla cavità addominale di topi BALB/c di 6 settimane iniettati 3-4 giorni prima.I tachizoiti sono stati lavati tre volte con PBS e purificati mediante centrifugazione in Percoll al 40% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Per ottenere tachizoiti del ceppo ME49, topi BALB/c sono stati iniettati per via intraperitoneale con 20 cisti tissutali e la trasformazione di tachizoiti nelle cisti è stata raccolta lavando la cavità addominale il 6-8° giorno dopo l'infezione (PI).Topi infettati con PBS.I tachizoiti ME49 sono stati coltivati ​​in cellule integrate con 100 μg/ml di penicillina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml di streptomicina (Gibco/BRL) e 5% di siero bovino fetale (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) a 37 °C e 5% di anidride carbonica.Dopo la coltivazione in cellule Vero, i tachizoiti ME49 sono stati fatti passare due volte attraverso un ago calibro 25 e poi attraverso un filtro da 5 µm per rimuovere detriti e cellule.Dopo il lavaggio, i tachizoiti sono stati risospesi in PBS44.Le cisti tissutali del ceppo ME49 di Toxoplasma gondii sono state mantenute mediante iniezione intraperitoneale di cisti isolate dal cervello di topi C57BL/6 infetti (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Corea).I cervelli di topi infetti da ME49 sono stati raccolti dopo 3 mesi di PI e tritati al microscopio per isolare le cisti.I topi infetti sono stati tenuti in speciali condizioni prive di agenti patogeni (SPF) presso la Seoul National University School of Medicine.
L'RNA totale è stato estratto da esosomi derivati ​​da BV2, cellule e tessuti BV2 utilizzando il mini kit miRNeasy (Qiagen, Hilden, Germania) secondo le istruzioni del produttore, incluso il tempo di incubazione per la fase di eluizione.La concentrazione di RNA è stata determinata su uno spettrofotometro NanoDrop 2000.La qualità dei microarray di RNA è stata valutata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Paesi Bassi).
DMEM con FBS povero di esosomi al 10% è stato preparato mediante ultracentrifugazione a 100.000 g per 16 ore a 4 ° C e filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Le cellule BV2, 5 × 105, sono state coltivate in DMEM contenente il 10% di FBS impoverito di esosomi e l'1% di antibiotici a 37 ° C e il 5% di CO2.Dopo 24 ore di incubazione, alle cellule sono stati aggiunti tachizoiti del ceppo RH o ME49 (MOI = 10) e i parassiti non invasori sono stati rimossi entro un'ora e ricaricati con DMEM.Gli esosomi delle cellule BV2 sono stati isolati mediante centrifugazione differenziale modificata, il metodo più utilizzato.Risospendere il pellet esosoma in 300 microlitri di PBS per l'analisi dell'RNA o delle proteine.La concentrazione di esosomi isolati è stata determinata utilizzando un kit di analisi proteica BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) e uno spettrofotometro NanoDrop 2000.
I precipitati da cellule BV2 o esosomi derivati ​​da BV2 sono stati lisati nella soluzione di estrazione proteica PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Corea) e le proteine ​​sono state caricate su gel di poliacrilammide SDS al 10% colorati con blu brillante Coomassie.Inoltre, le proteine ​​sono state trasferite alle membrane PVDF per 2 ore.Le macchie occidentali sono state convalidate utilizzando l'anticorpo Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) come marcatore esosomiale.IgG anti-topo di capra coniugata con HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) e un analizzatore di immagini luminescenti LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Giappone) sono stati usati come anticorpo secondario..La microscopia elettronica a trasmissione è stata eseguita per studiare le dimensioni e la morfologia degli esosomi.Gli esosomi isolati dalle cellule BV2 (6,40 µg/µl) sono stati preparati su reti rivestite di carbonio e colorati negativamente con acetato di uranile al 2% per 1 minuto.I campioni preparati sono stati osservati a una tensione di accelerazione di 80 kV utilizzando un JEOL 1200-EX II (Tokyo, Giappone) dotato di una telecamera CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Gli esosomi derivati ​​da BV2 sono stati colorati utilizzando il kit PKH26 Red Fluorescent Linker (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per 15 minuti a temperatura ambiente.Cellule U87, 2×105, con esosomi marcati con PKH26 (rossi) o senza esosomi come controllo negativo, sono state incubate a 37°C per 24 ore in un incubatore di CO2 al 5%.I nuclei delle cellule U87 sono stati colorati con DAPI (blu), le cellule U87 sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a 4 ° C e quindi analizzate in un sistema di microscopio confocale Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Germania).osservabile.
Il cDNA è stato sintetizzato da siRNA utilizzando la sintesi del primo filamento di siRNA Mir-X e il kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Giappone).La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando il sistema di rilevamento PCR in tempo reale iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) utilizzando primer e modelli miscelati con SYBR Premix.Il DNA è stato amplificato per 40 cicli di denaturazione a 95°C per 15 s e ricottura a 60°C per 60 s.I dati di ciascuna reazione PCR sono stati analizzati utilizzando il modulo di analisi dei dati del software del sistema ottico iQ™5 (Bio-Rad).I cambiamenti relativi nell'espressione genica tra geni bersaglio selezionati e β-actina/siRNA (e U6) sono stati calcolati utilizzando il metodo della curva standard.Le sequenze di primer utilizzate sono mostrate nella Tabella 1.
3 x 104 cellule di glioma U87 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e miscelate con esosomi infetti da Toxoplasma derivati ​​da BV2 (50 μg/mL) o esosomi non pulsati derivati ​​da BV2 (50 μg/mL) come controlli a 12, 18 e 36 ore .Il tasso di proliferazione cellulare è stato determinato utilizzando il Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Giappone) (Figure supplementari S1-S3) 46 .
Topi nudi BALB/c femmina di 5 settimane sono stati acquistati da Orient Bio (Seongnam-si, Corea del Sud) e tenuti individualmente in gabbie sterili a temperatura ambiente (22±2°C) e umidità (45±15°C).%) a temperatura ambiente (22±2°C) e umidità (45±15%).Un ciclo di luce di 12 ore e un ciclo di buio di 12 ore sono stati eseguiti sotto SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).I topi sono stati divisi casualmente in tre gruppi di 5 topi ciascuno e a tutti i gruppi sono stati iniettati per via sottocutanea 400 ml di PBS contenente 1 x 107 cellule di glioma U87 e BD Matrigel™ con fattore di crescita ridotto (BD Science, Miami, FL, USA).Sei giorni dopo l'iniezione del tumore, sono stati iniettati nel sito del tumore 200 mg di esosomi derivati ​​da cellule BV2 (con/senza infezione da Toxoplasma).Ventidue giorni dopo l'infezione del tumore, la dimensione del tumore dei topi in ciascun gruppo è stata misurata con un calibro tre volte alla settimana e il volume del tumore è stato calcolato con la formula: 0,5 × (larghezza) × 2 × lunghezza.
Analisi dell'espressione di microRNA utilizzando miRCURYTM LNA miRNA array, 7th generation has, mmu e rno array (EXIQON, Vedbaek, Danimarca) che coprono 1119 topi ben caratterizzati tra 3100 sonde di cattura di miRNA umane, di topo e di ratto.Durante questa procedura, dal 5′-fosfato sono stati rimossi da 250 a 1000 ng di RNA totale mediante trattamento con fosfatasi alcalina intestinale di vitello seguito da etichettatura con colorante fluorescente verde Hy3.I campioni etichettati sono stati quindi ibridati caricando vetrini di microarray utilizzando un kit di camera di ibridazione (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) e un kit di vetrini di ibridazione (Agilent Technologies).L'ibridazione è stata condotta per 16 ore a 56°C, quindi i microarray sono stati lavati secondo le raccomandazioni del produttore.I vetrini di microarray elaborati sono stati quindi scansionati utilizzando un sistema di scanner per microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Le immagini scansionate sono state importate utilizzando il software Agilent Feature Extraction versione 10.7.3.1 (Agilent Technologies) e l'intensità di fluorescenza di ciascuna immagine è stata quantificata utilizzando il file GAL corrispondente del protocollo Exiqon modificato.I dati di microarray per lo studio corrente sono depositati nel database GEO con il numero di accesso GPL32397.
I profili di espressione di miRNA esosomiali maturi nella microglia di ceppi RH o ME49 infettati da Toxoplasma sono stati analizzati utilizzando vari strumenti di rete.i miRNA associati allo sviluppo del tumore sono stati identificati utilizzando miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) e filtrati con intensità del segnale normalizzata (log2) maggiore di 8.0.Tra i miRNA, i miRNA espressi in modo differenziato sono risultati alterati di oltre 1,5 volte dall'analisi del filtro dei miRNA alterati da ceppi RH o ME49 infettati da T. gondii.
Le cellule sono state seminate in piastre a sei pozzetti (3 x 105 cellule/pozzetto) in opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Le cellule trasfettate sono state coltivate per 6 ore e quindi il terreno è stato cambiato in terreno completo fresco.Le cellule sono state raccolte 24 ore dopo la trasfezione.
L'analisi statistica è stata eseguita principalmente utilizzando il test t di Student con il software Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Per l'analisi sperimentale sugli animali, è stata eseguita un'ANOVA a due vie utilizzando il software Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). I valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. I valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. I valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. I valori P <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
Tutti i protocolli sperimentali utilizzati in questo studio sono stati approvati dall'Institutional Review Board della Seoul National University School of Medicine (numero IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
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