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I vettori genici per il trattamento della fibrosi cistica polmonare devono essere mirati alle vie aeree conduttive, poiché la trasduzione polmonare periferica non ha alcun effetto terapeutico.L'efficienza della trasduzione virale è direttamente correlata al tempo di residenza del portatore.Tuttavia, i fluidi di rilascio come i portatori di geni si diffondono naturalmente negli alveoli durante l'inalazione e le particelle terapeutiche di qualsiasi forma vengono rapidamente rimosse dal trasporto mucociliare.L'estensione del tempo di residenza dei portatori di geni nel tratto respiratorio è importante ma difficile da ottenere.Le particelle magnetiche coniugate al portatore che possono essere dirette alla superficie delle vie respiratorie possono migliorare il targeting regionale.A causa di problemi con l'imaging in vivo, il comportamento di tali piccole particelle magnetiche sulla superficie delle vie aeree in presenza di un campo magnetico applicato è poco conosciuto.Lo scopo di questo studio era utilizzare l'imaging di sincrotrone per visualizzare in vivo il movimento di una serie di particelle magnetiche nella trachea di ratti anestetizzati al fine di studiare la dinamica e i modelli di comportamento di particelle singole e di massa in vivo.Abbiamo quindi anche valutato se la consegna di particelle magnetiche lentivirali in presenza di un campo magnetico aumenterebbe l'efficienza della trasduzione nella trachea del ratto.L'imaging a raggi X di sincrotrone mostra il comportamento delle particelle magnetiche in campi magnetici stazionari e in movimento in vitro e in vivo.Le particelle non possono essere facilmente trascinate sulla superficie delle vie aeree viventi utilizzando i magneti, ma durante il trasporto i depositi si concentrano nel campo visivo, dove il campo magnetico è più forte.Anche l'efficienza di trasduzione è aumentata di sei volte quando le particelle magnetiche lentivirali sono state erogate in presenza di un campo magnetico.Presi insieme, questi risultati suggeriscono che le particelle magnetiche lentivirali e i campi magnetici possono essere approcci preziosi per migliorare il targeting del vettore genico e i livelli di trasduzione nelle vie aeree conduttive in vivo.
La fibrosi cistica (CF) è causata da variazioni in un singolo gene chiamato regolatore di conduttanza transmembrana CF (CFTR).La proteina CFTR è un canale ionico presente in molte cellule epiteliali in tutto il corpo, comprese le vie aeree, un sito importante nella patogenesi della fibrosi cistica.I difetti nel CFTR portano a un trasporto di acqua anormale, disidratazione della superficie delle vie aeree e diminuzione della profondità dello strato fluido superficiale delle vie aeree (ASL).Inoltre compromette la capacità del sistema di trasporto mucociliare (MCT) di liberare le vie aeree dalle particelle inalate e dagli agenti patogeni.Il nostro obiettivo è sviluppare una terapia genica lentivirale (LV) per fornire la copia corretta del gene CFTR e migliorare ASL, MCT e salute polmonare e continuare a sviluppare nuove tecnologie in grado di misurare questi parametri in vivo1.
I vettori LV sono uno dei principali candidati per la terapia genica della fibrosi cistica, principalmente perché possono integrare in modo permanente il gene terapeutico nelle cellule basali delle vie aeree (cellule staminali delle vie aeree).Questo è importante perché possono ripristinare la normale idratazione e la clearance del muco differenziandosi in cellule superficiali delle vie aeree corrette dal gene e funzionali associate alla fibrosi cistica, con conseguenti benefici per tutta la vita.I vettori LV devono essere diretti contro le vie aeree conduttive, poiché è qui che inizia il coinvolgimento polmonare nella FC.La consegna del vettore più in profondità nel polmone può provocare la trasduzione alveolare, ma questo non ha alcun effetto terapeutico nella fibrosi cistica.Tuttavia, fluidi come i portatori di geni migrano naturalmente negli alveoli quando vengono inalati dopo il parto3,4 e le particelle terapeutiche vengono rapidamente espulse nella cavità orale dagli MCT.L'efficienza della trasduzione LV è direttamente correlata al periodo di tempo in cui il vettore rimane vicino alle cellule bersaglio per consentire l'assorbimento cellulare - "tempo di residenza" 5 che è facilmente accorciato dal tipico flusso d'aria regionale e dall'assorbimento coordinato di muco e particelle MCT.Per la fibrosi cistica, la capacità di prolungare il tempo di permanenza del ventricolo sinistro nelle vie aeree è importante per raggiungere alti livelli di trasduzione in quest'area, ma finora è stata una sfida.
Per superare questo ostacolo, proponiamo che le particelle magnetiche LV (MP) possano aiutare in due modi complementari.In primo luogo, possono essere guidati da un magnete sulla superficie delle vie aeree per migliorare il targeting e aiutare le particelle portatrici di geni a trovarsi nella giusta area delle vie aeree;e ASL) si spostano nello strato cellulare 6. Le MP sono ampiamente utilizzate come veicoli mirati per la somministrazione di farmaci quando si legano ad anticorpi, farmaci chemioterapici o altre piccole molecole che si attaccano alle membrane cellulari o si legano ai rispettivi recettori della superficie cellulare e si accumulano nei siti tumorali in presenza di elettricità statica.Campi magnetici per la terapia del cancro 7. Altri metodi "ipertermici" mirano a uccidere le cellule tumorali riscaldando MP quando esposti a campi magnetici oscillanti.Il principio della trasfezione magnetica, in cui un campo magnetico viene utilizzato come agente di trasfezione per migliorare il trasferimento del DNA nelle cellule, è comunemente utilizzato in vitro utilizzando una gamma di vettori genici non virali e virali per linee cellulari difficili da trasdurre ..È stata stabilita l'efficienza della magnetotransfezione LV con la consegna di LV MP in vitro in una linea cellulare di epitelio bronchiale umano in presenza di un campo magnetico statico, aumentando l'efficienza della trasduzione di 186 volte rispetto al solo vettore LV.LV MT è stato applicato anche a un modello in vitro di fibrosi cistica, in cui la trasfezione magnetica ha aumentato la trasduzione LV nelle colture di interfaccia aria-liquido di un fattore 20 in presenza di espettorato di fibrosi cistica10.Tuttavia, la magnetotrasfezione di organi in vivo ha ricevuto relativamente poca attenzione ed è stata valutata solo in pochi studi sugli animali11,12,13,14,15, specialmente nei polmoni16,17.Tuttavia, le possibilità di trasfezione magnetica nella terapia polmonare nella fibrosi cistica sono chiare.Tan et al.(2020) hanno affermato che "uno studio di convalida sull'efficace rilascio polmonare di nanoparticelle magnetiche aprirà la strada a future strategie di inalazione di CFTR per migliorare gli esiti clinici nei pazienti con fibrosi cistica"6.
Il comportamento di piccole particelle magnetiche sulla superficie delle vie respiratorie in presenza di un campo magnetico applicato è difficile da visualizzare e studiare, e quindi sono poco conosciuti.In altri studi, abbiamo sviluppato un metodo di imaging a raggi X a contrasto di fase basato sulla propagazione di sincrotrone (PB-PCXI) per l'imaging non invasivo e la quantificazione di minuscole variazioni in vivo nella profondità dell'ASL18 e nel comportamento MCT19, 20 per misurare direttamente l'idratazione della superficie del canale del gas ed è utilizzato come indicatore precoce dell'efficacia del trattamento.Inoltre, il nostro metodo di punteggio MCT utilizza particelle di diametro compreso tra 10 e 35 µm composte da allumina o vetro ad alto indice di rifrazione come marcatori MCT visibili con PB-PCXI21.Entrambi i metodi sono adatti per l'imaging di una gamma di tipi di particelle, inclusi i MP.
A causa dell'elevata risoluzione spaziale e temporale, i nostri saggi ASL e MCT basati su PB-PCXI sono adatti per studiare le dinamiche e i modelli comportamentali di particelle singole e di massa in vivo per aiutarci a comprendere e ottimizzare i metodi di consegna del gene MP.L'approccio che utilizziamo qui si basa sui nostri studi che utilizzano la linea di luce SPring-8 BL20B2, in cui abbiamo visualizzato il movimento del fluido in seguito alla somministrazione di una dose di un vettore fittizio nelle vie aeree nasali e polmonari dei topi per aiutare a spiegare i nostri modelli di espressione genica eterogenei osservati nel nostro gene.studi su animali con una dose di portatore di 3,4 .
Lo scopo di questo studio era utilizzare il sincrotrone PB-PCXI per visualizzare i movimenti in vivo di una serie di MP nella trachea di ratti vivi.Questi studi di imaging PB-PCXI sono stati progettati per testare la serie MP, l'intensità del campo magnetico e la posizione per determinare il loro effetto sul movimento MP.Abbiamo ipotizzato che un campo magnetico esterno avrebbe aiutato l'MF erogato a rimanere oa spostarsi nell'area target.Questi studi ci hanno anche permesso di determinare le configurazioni dei magneti che massimizzano la quantità di particelle rimaste nella trachea dopo la deposizione.In una seconda serie di studi, abbiamo mirato a utilizzare questa configurazione ottimale per dimostrare il pattern di trasduzione risultante dalla consegna in vivo di LV-MP alle vie aeree del ratto, supponendo che la consegna di LV-MP nel contesto del targeting delle vie aeree risulterebbe in una maggiore efficienza di trasduzione LV..
Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con i protocolli approvati dall'Università di Adelaide (M-2019-060 e M-2020-022) e dal comitato etico degli animali di sincrotrone SPring-8.Gli esperimenti sono stati condotti secondo le raccomandazioni di ARRIVE.
Tutte le immagini a raggi X sono state scattate alla linea di luce BL20XU presso il sincrotrone SPring-8 in Giappone utilizzando una configurazione simile a quella descritta in precedenza21,22.In breve, la scatola sperimentale si trovava a 245 m dall'anello di accumulazione del sincrotrone.Una distanza campione-rilevatore di 0,6 m viene utilizzata per studi di imaging delle particelle e 0,3 m per studi di imaging in vivo per creare effetti di contrasto di fase.È stato utilizzato un fascio monocromatico con un'energia di 25 keV.Le immagini sono state acquisite utilizzando un trasduttore a raggi X ad alta risoluzione (SPring-8 BM3) accoppiato a un rivelatore sCMOS.Il trasduttore converte i raggi X in luce visibile utilizzando uno scintillatore spesso 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), che viene quindi diretto al sensore sCMOS utilizzando un obiettivo per microscopio ×10 (NA 0,3).Il rilevatore sCMOS era un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Giappone) con una dimensione dell'array di 2048 × 2048 pixel e una dimensione dei pixel grezzi di 6,5 × 6,5 µm.Questa impostazione fornisce una dimensione pixel isotropica effettiva di 0,51 µm e un campo visivo di circa 1,1 mm × 1,1 mm.La durata dell'esposizione di 100 ms è stata scelta per massimizzare il rapporto segnale-rumore delle particelle magnetiche all'interno e all'esterno delle vie aeree, riducendo al minimo gli artefatti da movimento causati dalla respirazione.Per gli studi in vivo, è stato posizionato un otturatore a raggi X rapido nel percorso dei raggi X per limitare la dose di radiazioni bloccando il raggio di raggi X tra le esposizioni.
I supporti LV non sono stati utilizzati in nessuno studio di imaging SPring-8 PB-PCXI perché la camera di imaging BL20XU non è certificata Livello 2 di biosicurezza.Invece, abbiamo selezionato una gamma di MP ben caratterizzati da due venditori commerciali che coprono una gamma di dimensioni, materiali, concentrazioni di ferro e applicazioni, prima per capire come i campi magnetici influenzano il movimento dei MP nei capillari di vetro, e poi in vie aeree viventi.superficie.La dimensione dell'MP varia da 0,25 a 18 µm ed è costituita da vari materiali (vedi Tabella 1), ma la composizione di ciascun campione, inclusa la dimensione delle particelle magnetiche nell'MP, è sconosciuta.Sulla base dei nostri ampi studi MCT 19, 20, 21, 23, 24, ci aspettiamo che MP fino a 5 µm possano essere visti sulla superficie delle vie aeree tracheali, ad esempio, sottraendo fotogrammi consecutivi per vedere una migliore visibilità del movimento MP.Un singolo MP di 0,25 µm è inferiore alla risoluzione del dispositivo di imaging, ma ci si aspetta che PB-PCXI rilevi il loro contrasto volumetrico e il movimento del liquido superficiale su cui sono depositati dopo essere stati depositati.
Campioni per ogni MP nella tabella.1 è stato preparato in capillari di vetro da 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) con un diametro interno di 0,63 mm.Le particelle corpuscolari sono disponibili in acqua, mentre le particelle CombiMag sono disponibili nel liquido proprietario del produttore.Ogni provetta è riempita per metà di liquido (circa 11 µl) e posizionata sul portacampioni (vedi Figura 1).I capillari di vetro sono stati posizionati orizzontalmente sul palco nella camera di imaging, rispettivamente, e posizionati ai bordi del liquido.Un magnete con guscio di nichel di 19 mm di diametro (28 mm di lunghezza) fatto di terre rare, neodimio, ferro e boro (NdFeB) (N35, cat. n. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una rimanenza di 1,17 T è stato attaccato a un tabella di trasferimento separata per ottenere Modificare in remoto la posizione durante il rendering.L'imaging a raggi X inizia quando il magnete è posizionato a circa 30 mm sopra il campione e le immagini vengono acquisite a 4 fotogrammi al secondo.Durante l'imaging, il magnete è stato avvicinato al tubo capillare di vetro (a una distanza di circa 1 mm) e quindi spostato lungo il tubo per valutare l'effetto dell'intensità del campo e della posizione.
Una configurazione di imaging in vitro contenente campioni MP in capillari di vetro nella fase di traslazione del campione xy.Il percorso del raggio di raggi X è contrassegnato da una linea tratteggiata rossa.
Una volta stabilita la visibilità in vitro dei MP, un sottogruppo di essi è stato testato in vivo su ratti albini Wistar femmina wild-type (~ 12 settimane di età, ~ 200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Giappone), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Giappone) e butorfanolo 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).I ratti sono stati anestetizzati con miscela Pharma (Giappone) mediante iniezione intraperitoneale.Dopo l'anestesia, sono stati preparati per l'imaging rimuovendo il pelo attorno alla trachea, inserendo un tubo endotracheale (ET; cannula endovenosa da 16 Ga, Terumo BCT) e immobilizzandoli in posizione supina su una piastra per imaging su misura contenente una sacca termica per mantenere la temperatura corporea.22. La lastra di imaging è stata quindi fissata al tavolino del campione nella scatola di imaging con una leggera angolazione per allineare la trachea orizzontalmente sull'immagine radiografica, come mostrato nella Figura 2a.
( a ) Impostazione dell'imaging in vivo nell'unità di imaging SPring-8, percorso del raggio di raggi X contrassegnato da una linea tratteggiata rossa.( b, c ) La localizzazione del magnete tracheale è stata eseguita in remoto utilizzando due telecamere IP montate ortogonalmente.Sul lato sinistro dell'immagine sullo schermo, è possibile vedere l'anello di filo che tiene la testa e la cannula di erogazione installata all'interno del tubo ET.
Un sistema di pompa a siringa telecomandato (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) che utilizza una siringa di vetro da 100 μl è stato collegato a un tubo PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) utilizzando un ago da 30 Ga.Contrassegnare il tubo per garantire che la punta sia nella posizione corretta nella trachea durante l'inserimento del tubo endotracheale.Utilizzando una micropompa, lo stantuffo della siringa è stato rimosso e la punta del tubo è stata immersa nel campione MP da erogare.Il tubo di erogazione caricato è stato quindi inserito nel tubo endotracheale, posizionando la punta nella parte più forte del nostro campo magnetico applicato previsto.L'acquisizione delle immagini è stata controllata utilizzando un rilevatore di respiro collegato alla nostra scatola di temporizzazione basata su Arduino e tutti i segnali (ad es. Temperatura, respirazione, apertura/chiusura dell'otturatore e acquisizione delle immagini) sono stati registrati utilizzando Powerlab e LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Durante l'imaging Quando l'alloggiamento non era disponibile, due telecamere IP (Panasonic BB-SC382) sono state posizionate a circa 90° l'una dall'altra e utilizzate per controllare la posizione del magnete rispetto alla trachea durante l'imaging (Figura 2b, c).Per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, è stata acquisita un'immagine per atto respiratorio durante il plateau del flusso respiratorio terminale.
Il magnete è collegato al secondo stadio, che può essere posizionato a distanza all'esterno del corpo di imaging.Sono state testate varie posizioni e configurazioni del magnete, tra cui: posto ad un angolo di circa 30° sopra la trachea (le configurazioni sono mostrate nelle Figure 2a e 3a);un magnete sopra l'animale e l'altro sotto, con i poli predisposti per l'attrazione (figura 3b)., un magnete sopra l'animale e uno sotto, con i poli impostati per la repulsione (Figura 3c), e un magnete sopra e perpendicolare alla trachea (Figura 3d).Dopo aver impostato l'animale e il magnete e caricato il MP in prova nella pompa a siringa, erogare una dose di 50 ml ad una velocità di 4 microlitri/sec al momento dell'acquisizione delle immagini.Il magnete viene quindi spostato avanti e indietro lungo o attraverso la trachea continuando ad acquisire immagini.
Configurazione del magnete per l'imaging in vivo (a) un magnete sopra la trachea con un angolo di circa 30°, (b) due magneti configurati per l'attrazione, (c) due magneti configurati per la repulsione, (d) un magnete sopra e perpendicolare al trachea.L'osservatore ha guardato dalla bocca ai polmoni attraverso la trachea e il raggio di raggi X è passato attraverso il lato sinistro del ratto ed è uscito dal lato destro.Il magnete viene spostato lungo la lunghezza delle vie aeree oa sinistra ea destra sopra la trachea in direzione del raggio di raggi X.
Abbiamo anche cercato di determinare la visibilità e il comportamento delle particelle nelle vie aeree in assenza di miscelazione della respirazione e della frequenza cardiaca.Pertanto, alla fine del periodo di imaging, gli animali sono stati soppressi umanamente a causa del sovradosaggio di pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip).Alcuni animali sono stati lasciati sulla piattaforma di imaging e, dopo la cessazione della respirazione e del battito cardiaco, il processo di imaging è stato ripetuto, aggiungendo una dose aggiuntiva di MP se non era visibile MP sulla superficie delle vie aeree.
Le immagini risultanti sono state corrette per il campo piatto e scuro e quindi assemblate in un filmato (20 fotogrammi al secondo; 15-25 × velocità normale a seconda della frequenza respiratoria) utilizzando uno script personalizzato scritto in MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tutti gli studi sulla consegna del vettore del gene LV sono stati condotti presso il Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'Università di Adelaide e miravano a utilizzare i risultati dell'esperimento SPring-8 per valutare se la consegna LV-MP in presenza di un campo magnetico potesse migliorare il trasferimento genico in vivo .Per valutare gli effetti della MF e del campo magnetico, sono stati trattati due gruppi di animali: a un gruppo è stato iniettato LV MF con posizionamento del magnete e all'altro gruppo è stato iniettato un gruppo di controllo con LV MF senza magnete.
I vettori del gene LV sono stati generati utilizzando metodi descritti in precedenza 25, 26 .Il vettore LacZ esprime un gene della beta-galattosidasi localizzato nel nucleo guidato dal promotore costitutivo MPSV (LV-LacZ), che produce un prodotto di reazione blu nelle cellule trasdotte, visibile su fronti e sezioni di tessuto polmonare.La titolazione è stata eseguita in colture cellulari contando manualmente il numero di cellule LacZ-positive utilizzando un emocitometro per calcolare il titolo in TU/ml.I carrier vengono crioconservati a -80°C, scongelati prima dell'uso e legati a CombiMag mediante miscelazione 1:1 e incubazione in ghiaccio per almeno 30 minuti prima della consegna.
Ratti Sprague Dawley normali (n = 3/gruppo, ~2-3 anestetizzati ip con una miscela di 0,4 mg/kg di medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) e 60 mg/kg di ketamina (Ilium, Australia) a 1 mese di età) ip ) iniezione e cannula orale non chirurgica con una cannula endovenosa da 16 Ga.Per garantire che il tessuto delle vie aeree tracheali riceva la trasduzione LV, è stato condizionato utilizzando il nostro protocollo di perturbazione meccanica precedentemente descritto in cui la superficie delle vie aeree tracheali è stata sfregata assialmente con un cestello metallico (N-Circle, estrattore di pietre di nitinol senza punta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Quindi, circa 10 minuti dopo la perturbazione nell'armadio di biosicurezza, è stata eseguita la somministrazione tracheale di LV-MP.
Il campo magnetico utilizzato in questo esperimento è stato configurato in modo simile a uno studio a raggi X in vivo, con gli stessi magneti tenuti sopra la trachea con morsetti per stent di distillazione (Figura 4).Un volume di 50 µl (aliquote 2 x 25 µl) di LV-MP è stato somministrato alla trachea (n = 3 animali) utilizzando una pipetta con punta in gel come descritto in precedenza.Il gruppo di controllo (n = 3 animali) ha ricevuto lo stesso LV-MP senza l'uso di un magnete.Dopo il completamento dell'infusione, la cannula viene rimossa dal tubo endotracheale e l'animale viene estubato.Il magnete rimane in posizione per 10 minuti prima di essere rimosso.Ai ratti è stata somministrata per via sottocutanea meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguita dalla sospensione dell'anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 1 mg/kg di atipamazolo cloridrato (Antisedan, Zoetis, Australia).I ratti sono stati tenuti al caldo e osservati fino al completo recupero dall'anestesia.
Dispositivo di erogazione LV-MP in una cappa di sicurezza biologica.Si può vedere che il manicotto Luer-lock grigio chiaro del tubo ET sporge dalla bocca e la punta della pipetta in gel mostrata nella figura viene inserita attraverso il tubo ET fino alla profondità desiderata nella trachea.
Una settimana dopo la procedura di somministrazione di LV-MP, gli animali sono stati umanamente sacrificati per inalazione di CO2 al 100% e l'espressione di LacZ è stata valutata utilizzando il nostro trattamento X-gal standard.I tre anelli cartilaginei più caudali sono stati rimossi per garantire che eventuali danni meccanici o ritenzione di liquidi dovuti al posizionamento del tubo endotracheale non fossero inclusi nell'analisi.Ciascuna trachea è stata tagliata longitudinalmente per ottenere due metà per l'analisi e collocata in una tazza contenente gomma siliconica (Sylgard, Dow Inc) utilizzando un ago Minutien (Fine Science Tools) per visualizzare la superficie luminale.La distribuzione e il carattere delle cellule trasdotte sono stati confermati dalla fotografia frontale utilizzando un microscopio Nikon (SMZ1500) con una fotocamera DigiLite e il software TCapture (Tucsen Photonics, Cina).Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento 20x (compresa l'impostazione massima per l'intera larghezza della trachea), con l'intera lunghezza della trachea visualizzata passo dopo passo, fornendo una sovrapposizione sufficiente tra ciascuna immagine per consentire alle immagini di essere "cucite".Le immagini di ciascuna trachea sono state quindi combinate in un'unica immagine composita utilizzando Composite Image Editor versione 2.0.3 (Microsoft Research) utilizzando l'algoritmo di movimento planare. L'area di espressione di LacZ all'interno delle immagini composite tracheali di ciascun animale è stata quantificata utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto28, utilizzando impostazioni di 0,35 <Tonalità <0,58, Saturazione> 0,15 e Valore <0,7. L'area di espressione di LacZ all'interno delle immagini composite tracheali di ciascun animale è stata quantificata utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto28, utilizzando impostazioni di 0,35 <Tonalità <0,58, Saturazione> 0,15 e Valore <0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. L'area di espressione di LacZ nelle immagini tracheali composite di ciascun animale è stata quantificata utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come precedentemente descritto28 utilizzando le impostazioni di 0,350,15 e valore<0,7.如 前所 述 ， 使用 自动 matlab 脚本 （r2020a ， mathworks） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 lacz 表达 区域 进行 ， 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度> 0,15 和值 <0,7 的 设置 设置如 前所 述 ， 自动 自动 matlab 脚本 （（r2020a ， matematica） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 .................... ANCA Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Le aree di espressione di LacZ su immagini composite della trachea di ciascun animale sono state quantificate utilizzando uno script MATLAB automatizzato (R2020a, MathWorks) come descritto in precedenza utilizzando impostazioni di 0,35 <tonalità <0,58, saturazione> 0,15 e valore <0,7.Tracciando i contorni del tessuto in GIMP v2.10.24, è stata creata manualmente una maschera per ogni immagine composita per identificare l'area del tessuto e prevenire eventuali falsi rilevamenti al di fuori del tessuto tracheale.Le aree colorate di tutte le immagini composite di ciascun animale sono state sommate per fornire l'area colorata totale per quell'animale.L'area dipinta è stata poi divisa per l'area totale della maschera per ottenere un'area normalizzata.
Ciascuna trachea è stata incorporata in paraffina e sezionata con uno spessore di 5 µm.Le sezioni sono state controcolorate con rosso veloce neutro per 5 minuti e le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio Nikon Eclipse E400, una fotocamera DS-Fi3 e un software di acquisizione degli elementi NIS (versione 5.20.00).
Tutte le analisi statistiche sono state eseguite in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).La significatività statistica è stata fissata a p ≤ 0,05.La normalità è stata testata utilizzando il test Shapiro-Wilk e le differenze nella colorazione LacZ sono state valutate utilizzando un test t non appaiato.
I sei MP descritti nella Tabella 1 sono stati esaminati da PCXI e la visibilità è descritta nella Tabella 2. Due MP di polistirene (MP1 e MP2; 18 µm e 0,25 µm, rispettivamente) non erano visibili da PCXI, ma i restanti campioni potevano essere identificati (gli esempi sono mostrati nella Figura 5).MP3 e MP4 sono debolmente visibili (10-15% Fe3O4; 0,25 µm e 0,9 µm, rispettivamente).Sebbene MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contenesse alcune delle particelle più piccole testate, era la più pronunciata.Il prodotto CombiMag MP6 è difficile da distinguere.In tutti i casi, la nostra capacità di rilevare gli MF è stata notevolmente migliorata spostando il magnete avanti e indietro parallelamente al capillare.Man mano che i magneti si allontanavano dal capillare, le particelle venivano estratte in lunghe catene, ma quando i magneti si avvicinavano e l'intensità del campo magnetico aumentava, le catene di particelle si accorciavano man mano che le particelle migravano verso la superficie superiore del capillare (vedi Video supplementare S1 : MP4), aumentando la densità delle particelle in superficie.Al contrario, quando il magnete viene rimosso dal capillare, l'intensità del campo diminuisce e gli MP si riorganizzano in lunghe catene che si estendono dalla superficie superiore del capillare (vedi Video supplementare S2: MP4).Dopo che il magnete smette di muoversi, le particelle continuano a muoversi per qualche tempo dopo aver raggiunto la posizione di equilibrio.Man mano che l'MP si avvicina e si allontana dalla superficie superiore del capillare, le particelle magnetiche tendono a trascinare i detriti attraverso il liquido.
La visibilità di MP sotto PCXI varia considerevolmente tra i campioni.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Tutte le immagini mostrate qui sono state scattate con un magnete posizionato a circa 10 mm direttamente sopra il capillare.I grandi cerchi apparenti sono bolle d'aria intrappolate nei capillari, che mostrano chiaramente le caratteristiche dei bordi in bianco e nero dell'immagine a contrasto di fase.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che esalta il contrasto.Si noti che i diametri dei circuiti magnetici in tutte le figure non sono in scala e sono circa 100 volte più grandi di quanto mostrato.
Mentre il magnete si sposta a sinistra ea destra lungo la parte superiore del capillare, l'angolo della stringa MP cambia per allinearsi con il magnete (vedere la Figura 6), delineando così le linee del campo magnetico.Per MP3-5, dopo che la corda raggiunge l'angolo di soglia, le particelle si trascinano lungo la superficie superiore del capillare.Ciò si traduce spesso in MP che si raggruppano in gruppi più grandi vicino a dove il campo magnetico è più forte (vedi Video supplementare S3: MP5).Ciò è particolarmente evidente anche quando si esegue l'imaging vicino all'estremità del capillare, che fa sì che l'MP si aggreghi e si concentri all'interfaccia liquido-aria.Le particelle nell'MP6, che erano più difficili da distinguere rispetto a quelle nell'MP3-5, non si trascinavano quando il magnete si muoveva lungo il capillare, ma le stringhe MP si dissociavano, lasciando le particelle in vista (vedi Video supplementare S4: MP6).In alcuni casi, quando il campo magnetico applicato veniva ridotto spostando il magnete a lunga distanza dal sito di imaging, eventuali MP rimanenti scendevano lentamente sulla superficie inferiore del tubo per gravità, rimanendo nella stringa (vedi Video supplementare S5: MP3) .
L'angolo della stringa MP cambia mentre il magnete si sposta a destra sopra il capillare.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 e (d) MP6.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che esalta il contrasto.Si prega di notare che i video aggiuntivi sono a scopo informativo in quanto rivelano importanti strutture delle particelle e informazioni dinamiche che non possono essere visualizzate in queste immagini statiche.
I nostri test hanno dimostrato che muovere il magnete avanti e indietro lentamente lungo la trachea facilita la visualizzazione della MF nel contesto di movimenti complessi in vivo.Non sono stati eseguiti test in vivo perché le perle di polistirene (MP1 e MP2) non erano visibili nel capillare.Ciascuno dei rimanenti quattro MF è stato testato in vivo con l'asse lungo del magnete posizionato sopra la trachea con un angolo di circa 30° rispetto alla verticale (vedere Figure 2b e 3a), in quanto ciò ha portato a catene MF più lunghe ed è stato più efficace piuttosto che un magnete..configurazione terminata.MP3, MP4 e MP6 non sono stati trovati nella trachea di nessun animale vivo.Durante la visualizzazione del tratto respiratorio dei ratti dopo aver ucciso umanamente gli animali, le particelle sono rimaste invisibili anche quando è stato aggiunto volume aggiuntivo utilizzando una pompa a siringa.MP5 aveva il più alto contenuto di ossido di ferro ed era l'unica particella visibile, quindi è stato utilizzato per valutare e caratterizzare il comportamento MP in vivo.
Il posizionamento del magnete sopra la trachea durante l'inserimento di MF ha provocato la concentrazione di molti MF nel campo visivo, ma non tutti.L'ingresso tracheale di particelle si osserva meglio negli animali soppressi umanamente.Figura 7 e video supplementare S6: MP5 mostra una rapida cattura magnetica e l'allineamento delle particelle sulla superficie della trachea ventrale, indicando che gli MP possono essere mirati alle aree desiderate della trachea.Durante la ricerca più distalmente lungo la trachea dopo l'erogazione di MF, alcuni MF sono stati trovati più vicini alla carena, il che indica un'intensità del campo magnetico insufficiente per raccogliere e trattenere tutti gli MF, poiché sono stati erogati attraverso la regione di massima intensità del campo magnetico durante la somministrazione di fluidi.processi.Tuttavia, le concentrazioni di MP postnatali erano più elevate intorno all'area dell'immagine, suggerendo che molti MP rimanevano nelle regioni delle vie aeree dove l'intensità del campo magnetico applicato era più alta.
Immagini di (a) prima e (b) dopo il rilascio di MP5 nella trachea di un ratto recentemente soppresso con un magnete posizionato appena sopra l'area di imaging.L'area raffigurata si trova tra due anelli cartilaginei.C'è del fluido nelle vie aeree prima che venga erogato il MP.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che esalta il contrasto.Queste immagini sono tratte dal video presente in S6: MP5 Supplementary Video.
Lo spostamento del magnete lungo la trachea in vivo ha comportato un cambiamento nell'angolo della catena MP sulla superficie delle vie aeree, simile a quello osservato nei capillari (vedere Figura 8 e Video supplementare S7: MP5).Tuttavia, nel nostro studio, i parlamentari non potevano essere trascinati lungo la superficie delle vie respiratorie viventi, come potrebbero fare i capillari.In alcuni casi, la catena MP si allunga man mano che il magnete si sposta a destra ea sinistra.È interessante notare che abbiamo anche scoperto che la catena di particelle cambia la profondità dello strato superficiale del fluido quando il magnete viene spostato longitudinalmente lungo la trachea e si espande quando il magnete viene spostato direttamente sopra la testa e la catena di particelle viene ruotata in posizione verticale (vedi Video supplementare S7).: MP5 a 0:09, in basso a destra).Il caratteristico schema di movimento è cambiato quando il magnete è stato spostato lateralmente attraverso la parte superiore della trachea (cioè, a sinistra oa destra dell'animale, piuttosto che lungo la trachea).Le particelle erano ancora chiaramente visibili durante il loro movimento, ma quando il magnete è stato rimosso dalla trachea, le punte delle stringhe di particelle sono diventate visibili (vedi Video supplementare S8: MP5, a partire da 0:08).Ciò concorda con il comportamento osservato del campo magnetico sotto l'azione di un campo magnetico applicato in un capillare di vetro.
Immagini di esempio che mostrano MP5 nella trachea di un topo anestetizzato vivo.(a) Il magnete viene utilizzato per acquisire immagini sopra ea sinistra della trachea, quindi (b) dopo aver spostato il magnete a destra.Il riquadro rosso indica l'ingrandimento che esalta il contrasto.Queste immagini provengono dal video presente nel video supplementare di S7: MP5.
Quando i due poli sono stati sintonizzati in un orientamento nord-sud sopra e sotto la trachea (cioè, attraendo; Fig. 3b), le corde MP apparivano più lunghe e si trovavano sulla parete laterale della trachea piuttosto che sulla superficie dorsale del trachea (vedi Appendice).Video S9:MP5).Tuttavia, alte concentrazioni di particelle in un sito (cioè la superficie dorsale della trachea) non sono state rilevate dopo la somministrazione di fluidi utilizzando un dispositivo a doppio magnete, che di solito si verifica con un singolo dispositivo a magnete.Quindi, quando un magnete è stato configurato per respingere i poli opposti (Figura 3c), il numero di particelle visibili nel campo visivo non è aumentato dopo la consegna.L'impostazione di entrambe le due configurazioni del magnete è impegnativa a causa dell'elevata intensità del campo magnetico che attrae o spinge rispettivamente i magneti.La configurazione è stata quindi modificata in un singolo magnete parallelo alle vie aeree ma che passava attraverso le vie aeree con un angolo di 90 gradi in modo che le linee di forza attraversassero ortogonalmente la parete tracheale (Figura 3d), un orientamento inteso a determinare la possibilità di aggregazione di particelle su la parete laterale.essere osservato.Tuttavia, in questa configurazione, non vi era alcun movimento di accumulo MF identificabile o movimento del magnete.Sulla base di tutti questi risultati, è stata scelta una configurazione con un singolo magnete e un orientamento di 30 gradi per gli studi in vivo sui portatori di geni (Fig. 3a).
Quando l'animale è stato fotografato più volte subito dopo essere stato sacrificato umanamente, l'assenza di movimento tissutale interferente significava che si potevano distinguere linee di particelle più fini e più corte nel chiaro campo intercartilagineo, che "oscillavano" in accordo con il movimento di traslazione del magnete.vedere chiaramente la presenza e il movimento delle particelle MP6.
Il titolo di LV-LacZ era 1,8 x 108 IU/mL e, dopo la miscelazione 1:1 con CombiMag MP (MP6), agli animali sono stati iniettati 50 µl di una dose tracheale di 9 x 107 IU/ml di veicolo LV (ovvero 4,5 x 106 TU/ratto).).).In questi studi, invece di spostare il magnete durante il travaglio, abbiamo fissato il magnete in una posizione per determinare se la trasduzione del ventricolo sinistro potesse (a) essere migliorata rispetto all'erogazione del vettore in assenza di un campo magnetico e (b) se le vie aeree potessero essere concentrato.Le cellule vengono trasdotte nelle aree bersaglio magnetico del tratto respiratorio superiore.
La presenza di magneti e l'uso di CombiMag in combinazione con i vettori LV non sembrano influire negativamente sulla salute degli animali, così come il nostro protocollo di consegna del vettore LV standard.Le immagini frontali della regione tracheale sottoposta a perturbazione meccanica (Figura 1 supplementare) hanno mostrato che il gruppo trattato con LV-MP aveva livelli di trasduzione significativamente più elevati in presenza di un magnete (Figura 9a).Nel gruppo di controllo era presente solo una piccola quantità di colorazione blu LacZ (Figura 9b).La quantificazione delle regioni normalizzate colorate con X-Gal ha mostrato che la somministrazione di LV-MP in presenza di un campo magnetico ha comportato un miglioramento di circa 6 volte (Fig. 9c).
Esempio di immagini composite che mostrano la trasduzione tracheale con LV-MP (a) in presenza di un campo magnetico e (b) in assenza di un magnete.(c) Miglioramento statisticamente significativo nell'area normalizzata della trasduzione LacZ nella trachea con l'uso di un magnete (* p = 0,029, t-test, n = 3 per gruppo, media ± errore standard della media).
Le sezioni colorate di rosso neutro (esempio mostrato nella Figura 2 supplementare) indicavano che le cellule colorate con LacZ erano presenti nello stesso campione e nella stessa posizione precedentemente riportata.
La sfida chiave nella terapia genica delle vie aeree rimane la localizzazione precisa delle particelle portatrici nelle aree di interesse e il raggiungimento di un alto livello di efficienza di trasduzione nel polmone mobile in presenza di flusso d'aria e rimozione attiva del muco.Per i portatori LV destinati al trattamento delle malattie respiratorie nella fibrosi cistica, l'aumento del tempo di permanenza delle particelle portatrici nelle vie aeree conduttive è stato finora un obiettivo irraggiungibile.Come sottolineato da Castellani et al., l'uso di campi magnetici per migliorare la trasduzione presenta vantaggi rispetto ad altri metodi di consegna genica come l'elettroporazione perché può combinare semplicità, economia, consegna localizzata, maggiore efficienza e tempi di incubazione più brevi.e possibilmente una dose inferiore di veicolo10.Tuttavia, la deposizione in vivo e il comportamento di particelle magnetiche nelle vie aeree sotto l'influenza di forze magnetiche esterne non è mai stata descritta, e infatti la capacità di questo metodo di aumentare i livelli di espressione genica nelle vie aeree viventi intatte non è stata dimostrata in vivo.
I nostri esperimenti in vitro sul sincrotrone PCXI hanno mostrato che tutte le particelle che abbiamo testato, ad eccezione del polistirene MP, erano visibili nella configurazione di imaging che abbiamo utilizzato.In presenza di un campo magnetico, i campi magnetici formano stringhe, la cui lunghezza è correlata al tipo di particelle e all'intensità del campo magnetico (ovvero, la vicinanza e il movimento del magnete).Come mostrato nella Figura 10, le stringhe che osserviamo si formano quando ogni singola particella si magnetizza e induce il proprio campo magnetico locale.Questi campi separati fanno sì che altre particelle simili si raccolgano e si connettano con movimenti di stringhe di gruppo a causa di forze locali dalle forze locali di attrazione e repulsione di altre particelle.
Diagramma che mostra (a, b) catene di particelle che si formano all'interno di capillari pieni di liquido e (c, d) una trachea piena d'aria.Si noti che i capillari e la trachea non sono disegnati in scala.Il pannello (a) contiene anche una descrizione dell'MF contenente particelle Fe3O4 disposte in catene.
Quando il magnete si è spostato sul capillare, l'angolo della stringa di particelle ha raggiunto la soglia critica per MP3-5 contenente Fe3O4, dopodiché la stringa di particelle non è più rimasta nella sua posizione originale, ma si è spostata lungo la superficie in una nuova posizione.magnete.Questo effetto probabilmente si verifica perché la superficie del capillare di vetro è sufficientemente liscia da consentire questo movimento.È interessante notare che l'MP6 (CombiMag) non si è comportato in questo modo, forse perché le particelle erano più piccole, avevano un rivestimento o una carica superficiale diversa o il fluido vettore proprietario ne influenzava la capacità di movimento.Anche il contrasto nell'immagine delle particelle CombiMag è più debole, suggerendo che il liquido e le particelle possono avere la stessa densità e quindi non possono muoversi facilmente l'uno verso l'altro.Le particelle possono anche rimanere bloccate se il magnete si muove troppo velocemente, indicando che l'intensità del campo magnetico non può sempre superare l'attrito tra le particelle nel fluido, suggerendo che l'intensità del campo magnetico e la distanza tra il magnete e l'area bersaglio non dovrebbero essere un fattore sorpresa.importante.Questi risultati indicano anche che sebbene i magneti possano catturare molte microparticelle che scorrono attraverso l'area target, è improbabile che si possa fare affidamento sui magneti per spostare le particelle CombiMag lungo la superficie della trachea.Pertanto, abbiamo concluso che gli studi in vivo LV MF dovrebbero utilizzare campi magnetici statici per indirizzare fisicamente aree specifiche dell'albero delle vie aeree.
Una volta che le particelle vengono immesse nel corpo, sono difficili da identificare nel contesto del complesso tessuto in movimento del corpo, ma la loro capacità di rilevamento è stata migliorata spostando il magnete orizzontalmente sopra la trachea per "muovere" le stringhe MP.Sebbene sia possibile l'imaging in tempo reale, è più facile discernere il movimento delle particelle dopo che l'animale è stato ucciso umanamente.Le concentrazioni di MP erano solitamente più alte in questa posizione quando il magnete era posizionato sopra l'area di imaging, sebbene alcune particelle si trovassero solitamente più in basso nella trachea.A differenza degli studi in vitro, le particelle non possono essere trascinate lungo la trachea dal movimento di un magnete.Questa scoperta è coerente con il modo in cui il muco che ricopre la superficie della trachea elabora tipicamente le particelle inalate, intrappolandole nel muco e successivamente eliminandole attraverso il meccanismo di clearance muco-ciliare.
Abbiamo ipotizzato che l'uso di magneti sopra e sotto la trachea per l'attrazione (Fig. 3b) potrebbe comportare un campo magnetico più uniforme, piuttosto che un campo magnetico altamente concentrato in un punto, con conseguente potenziale distribuzione più uniforme delle particelle..Tuttavia, il nostro studio preliminare non ha trovato prove chiare a sostegno di questa ipotesi.Allo stesso modo, l'impostazione di una coppia di magneti per respingere (Fig. 3c) non ha comportato un ulteriore insediamento di particelle nell'area dell'immagine.Questi due risultati dimostrano che la configurazione a doppio magnete non migliora significativamente il controllo locale del puntamento MP e che le forti forze magnetiche risultanti sono difficili da regolare, rendendo questo approccio meno pratico.Allo stesso modo, anche l'orientamento del magnete sopra e attraverso la trachea (Figura 3d) non ha aumentato il numero di particelle rimaste nell'area dell'immagine.Alcune di queste configurazioni alternative potrebbero non avere successo in quanto comportano una riduzione dell'intensità del campo magnetico nella zona di deposizione.Pertanto, la configurazione a singolo magnete a 30 gradi (Fig. 3a) è considerata il metodo di test in vivo più semplice ed efficiente.
Lo studio LV-MP ha mostrato che quando i vettori LV sono stati combinati con CombiMag e consegnati dopo essere stati disturbati fisicamente in presenza di un campo magnetico, i livelli di trasduzione sono aumentati significativamente nella trachea rispetto ai controlli.Sulla base degli studi di imaging di sincrotrone e dei risultati di LacZ, il campo magnetico sembrava essere in grado di mantenere il ventricolo sinistro nella trachea e ridurre il numero di particelle vettoriali che penetravano immediatamente in profondità nel polmone.Tali miglioramenti mirati possono portare a una maggiore efficienza riducendo i titoli erogati, la trasduzione non mirata, gli effetti collaterali infiammatori e immunitari e i costi di trasferimento genico.È importante sottolineare che, secondo il produttore, CombiMag può essere utilizzato in combinazione con altri metodi di trasferimento genico, inclusi altri vettori virali (come AAV) e acidi nucleici.